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脊髓损伤的发病机制和治疗手段一直是神经科学领域的研究热点和难点,本课题组前期在蛋白质组学研究中发现了tau蛋白的明显上调表达,这引起了我们的关注。Tau蛋白是一种微管相关蛋白,因为现阶段对tau蛋白的研究重心仍然集中在阿尔兹海默症等中枢神经系统疾病上,并发现了神经元内tau蛋白的高表达往往与神经性损伤密切相关,但是tau蛋白在脊髓损伤这种外周神经系统疾病中的表达特点鲜有研究,所以本实验首先通过免疫组化和免疫印迹法定性定量观察tau蛋白在脊髓损伤组织中的表达变化特点,为脊髓损伤后tau蛋白的表达提供理论依据。目前针对脊髓损伤传统的内外科治疗手段均存在一定局限,随着细胞生物学近几年的巨大进步,细胞移植作为一种脊髓损伤的新型治疗手段受到了广泛关注和研究,神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),因其具有可分化成为神经元和少突胶质细胞的潜能,同时可以释放神经递质、产生神经营养因子等强大优势,被视为治疗脊髓损伤的新型手段。NSCs移植治疗脊髓损伤最重要的决定性因素就是NSCs的迁移能力和分化能力,本实验重点关注tau蛋白对NSCs迁移能力的影响。本课题组杨茂光博士前期研究发现微管相关蛋白对细胞迁移存在一定影响,而目前研究也已表明微管相关蛋白tau对于神经元迁移确实具有不可或缺作用,虽然机制尚不明确,但是猜测蛋白的翻译后修饰如磷酸化修饰很有可能发挥关键作用。而微管相关蛋白tau的磷酸化修饰对于NSCs迁移的影响以及该过程所涉及的相关信号通路国内外尚未见相关报道。所以本实验通过蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)抑制剂和激动剂改变NSCs内tau蛋白的磷酸化状态,利用transwell和NSCs移植分别从体外和体内对处理后的NSCs迁移能力进行评估,同时观察PI3K,ERK,p38MAPK和JNK通路对tau蛋白磷酸化和NSCs迁移能力的影响,从而为NSCs迁移过程中的影响因素和相关信号传导机制提供新思路,为临床工作中NSCs移植治疗脊髓损伤提供理论基础。研究目的:研究目的:观察tau蛋白在脊髓损伤中的表达变化特点,探讨tau蛋白磷酸化修饰对NSCs迁移能力的影响,为NSCs迁移过程中的影响因素和相关信号传导机制提供新思路,为临床工作中NSCs移植治疗脊髓损伤提供理论基础。研究方法:1、大鼠脊髓损伤动物模型建立20只SD大鼠随机分为假手术组和脊髓损伤组,通过阻断SD大鼠的腹主动脉构建脊髓缺血损伤动物模型,分别在造模后的1,3,5天利用改良Tarlov标准对脊髓缺血损伤后大鼠的运动神经功能进行评价。利用Hematoxylin-Eosin(HE)染色观察脊髓损伤组织的病理学变化特点。2、神经干细胞培养取怀孕14天的KM雌性小鼠的胎鼠,解剖显微镜下分离海马组织,机械分离后加入神经干细胞培养基,以5×105的浓度接种于培养瓶中。连续7天在光镜下观察细胞形态,通过Nestin免疫荧光对培养神经球进行鉴定。3、tau蛋白在脊髓损伤中的表达制作脊髓损伤动物模型,在造模后的第1,3,5天取脊髓损伤组和假手术组大鼠的腰髓组织,分别应用免疫组化和免疫印迹法对脊髓组织中的tau蛋白进行定性定量观察。4、tau蛋白磷酸化修饰对NSCs迁移能力的影响分别利用PP2A抑制剂冈田酸(Okadaic acid;OA)和PP2A激动剂乙酰化-D-赤式-二氢神经鞘氨醇(N-acetyl-D-erythro-Sphingosine;C2-ceramide)预处理NSCs,MTT法测定经预处理的NSCs活性,通过同位素32P标记蛋白底物法测定预处理后NSCs内PP2A的活性。将NSCs分为OA组,C2-ceramide组,未预处理组和对照组共4组。应用免疫印迹法观察4组NSCs内tau蛋白的磷酸化水平,通过Transwell小室实验在体外对4组NSCs迁移能力进行评估。将DAPI标记的NSCs通过静脉移植入脊髓损伤动物模型中,3天后观察脊髓损伤节段处的NSCs迁移情况。5、NSCs迁移涉及的相关细胞通路探讨分别应用特异性阻断剂剂LY294002,U0126,SP600125,SB203580阻断NSCs内PI3K,ERK1/2,JNK,p38MAPK通路,应用western blot观察处理后的NSCs内p-tau的表达,通过transwell实验观察NSCs的迁移情况。研究结果:1、在造模后的1,3,5天对大鼠进行后肢运动功能评分,结果示假手术组的后肢功能评分均为6分,脊髓损伤组大鼠Tarlov评分为2-3分,与假手术组存在显著差异。HE染色显示脊髓损伤组随着术后时间推进,脊髓病理组织学改变呈加重趋势,在缺血初期,仅仅表现为神经细胞胞体肿胀变形,间质轻度水肿,而在术后第5天时则出现大量神经元的死亡,以及重度水肿甚至坏死灶。Tarlov评分和HE染色表明脊髓损伤动物模型建立成功。2、胎鼠海马分离得到的细胞经过原代培养、增殖和传代形成神经球,3-5d形成的神经球折光性最好,周边边界清楚,未见突起生长,Nestin免疫荧光呈阳性。3、免疫组化示正常脊髓组织中的神经元形态正常,tau蛋白在神经元的轴突和胞浆中呈阳性表达,阳性细胞数较少。脊髓损伤组在术后1,3,5天可见神经元肿胀变形程度逐渐加重,胶质细胞反应性增多。神经元胞浆中的tau蛋白明显阳性表达,随着神经元损伤程度的加重,tau蛋白表达阳性的神经元数量和光密度值均不断增加,免疫印迹法示脊髓组织的tau蛋白表达量在造模后的1,3,5天同样呈递增趋势。4、32P标记蛋白底物法显示OA和C2-ceramide分别对PP2A活性产生了明显的抑制和激动效果,MTT示预处理后的NSCs生长受到轻微抑制,生长状况良好可满足后续实验。免疫印迹法示OA组,未预处理组和C2-ceramide组的NSCs内tau表达水平在处理后的1,3,5天均无显著差异。处理后第1天时OA组的p-tau表达明显高于未预处理组,C2-ceramide组的p-tau表达显著低于未预处理组。随后OA组和C2-ceramide组的p-tau表达水平分别呈递减和递增趋势,并于第5天恢复至未预处理组水平。Transwell小室实验示未预处理组NSCs迁移能力最高,而OA组和C2-ceramide组的NSCs迁移能力均出现不同程度的下降。DAPI标记NSCs移植入脊髓损伤动物模型后,脊髓损伤节段处可见标记细胞迁移,其中未预处理组的NSCs迁移数量最多,OA组和C2-ceramide组迁移数量显著低于未预处理组。5、免疫印迹示PI3K处理后NSCs内p-tau表达显著升高,ERK1/2,JNK,p38MAPK处理后NSCs内p-tau表达显著降低,transwell示这4组的NSCs迁移能力相对未处理的NSCs均明显下降。研究结论:1、脊髓损伤中的tau蛋白呈明显上调表达,神经元中tau蛋白的表达量和tau蛋白阳性的神经元数量均与神经组织损伤程度呈正相关。2、NSCs具备向损伤处靶向迁移的能力,NSCs内tau蛋白磷酸化/去磷酸化精确的动态平衡是保证NSCs正常迁移的必备因素,PI3K,ERK,p38MAPK和JNK通路对其下游分子tau蛋白磷酸化的调控在NSCs迁移过程中发挥重要作用。创新点:1、对tau蛋白在脊髓损伤中的表达特点进行了探讨。2、阐述tau蛋白的磷酸化修饰对NSCs迁移能力的影响,国内外未见相关报道。3、补充完善了NSCs内调控tau蛋白磷酸化的信号通路以及NSCs迁移过程所涉及的细胞通路。