研究目的：基于PET研究针刺作用机理,已经成为近年针刺研究领域的热点之一,并且,取得了不少的研究成果。既往的研究,肯定了针刺的中枢效应；肯定了穴位具有特异性,表现在针刺某一穴位时,激活某一脑区群；肯定了针刺穴位的特异性,主要受两个方面的影响：一是穴位的定位；二是针刺的刺激方式。同时,也不难看到,既往的研究,大都局限在对针刺即时效应的研究层面。而我们知道,临床上针刺发挥治疗效应,更多的是依据针刺的疗程效应,也就是要经过1个或几个疗程的治疗后,才能或更好的发挥治疗效果,尤其是对AD这样的慢性疾病,长期积累的治疗,远比即时的治疗更为重要。本研究分别对针刺足三里状态下的PET效应及经过针刺足三里治疗后的PET效应进行观察,以期提示针刺足三里穴治疗AD模型大鼠的机制。方法：实验动物与分组：全部75SD大鼠,雄性38只,雌性37只,2月龄。75只动物分笼置于室温18-22℃,湿润,12：12可控制照明与黑暗的动物房内分笼喂养。适应性喂养一周后,按照随机数字表原则对实验动物分成两组：正常组15只(雄8,雌7)；—造模组60只(雄30,雌30)。动物适应性喂养1周后,造模组的60只大鼠腹腔注射0.96% d-gal(NS配制),按5ml/kg体重给药,每日一次,连续六周。造模组从第七周开始进行脑内双侧nbM核注射IBO。方法：大鼠以3%戊巴比妥钠35mg/kg体重腹腔麻醉,将大鼠固定于脑立体定位仪上,纵向切开头皮,暴露颅骨,参照paxins和watson大鼠脑立体定位图谱,nbM核坐标为AP-0.8mm, Lat 2.6mm, DV-8.2mm(前囟后0.8mm,中线旁开2.6mm,颅骨下8.2mm),每侧缓慢注射IBA 1μl(NS配制,浓度5μg/μl),注射时间每侧10min,留针10min。手术后各组大鼠以青霉素钠抗炎3天。两周后,造模组60只大鼠中,有15只(雄7只,雌8只)死于造模过程中。45只AD模型大鼠再按随机数字表原则随机分为3组：模型组15只(雄7只,雌8只)；非穴组15只(雄7只,雌8只)；足三里组15只(雄8只,雌7只)。以上三组,连同正常对照组,共4组60只动物进入下一步实验。针刺手法：中研太和0.18x9mm毫针针刺,均匀捻转,幅度±180度,频率200次/min,足三里、非穴深度约3mm；持续刺激3分钟,休息2分钟,如此反复,持续10分钟。针刺治疗：针刺用一次性无菌使用针灸针(0.18*9mm),穴位定位,去毛,常规消毒皮肤后,手持针柄垂直进针；足三里、非穴点进针深度均约3mm；进针到3mm深度后,均匀捻转针体,幅度±180度,频率200次/min,持续刺激3分钟,休息10分钟,再刺激3分钟,休息10分钟,如此反复,每次治疗持续30分钟；每天治疗1次,20天为一个疗程。模型组及正常组喂养同足三里组、非穴组,但未接受任何特殊处理。Y迷宫测试：各组大鼠学习记忆能力测试在Y迷宫系统中进行。实验在安静、光线较暗的环境中由专人负责进行,训练时间固定。学习测试：让大鼠在起步区适应3-5min后,按一定规律或随机变换安全区与电击区,以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。电刺激参数：延时5s；电压50V—-70V。以大鼠在足底通电后10s内一次性跑向安全区为正确反应,否则为错误反应。具体训练方法：安全区以Ⅰ—Ⅱ-—Ⅲ—Ⅰ臂顺序变换；大鼠逃到安全区后,灯光继续作用10—15s,熄灯后结束一次测试,大鼠所在支臂作为下一次测试的起点,休息30—60s后再予以第2次测试,依次重复,每天固定训练20次,前3天为学习阶段,第4天为短期记忆测试,第31天为长期记忆测试。Y迷宫测试指标：全天总反应时间(total reaction time, TRT)。第一部分PET扫描：以上4组60只大鼠经24小时饥饿后,于早上8点之前送达中国人民解放军301医院PET实验动物中心,后按以下顺序开展工作：(1)在暗室内放置20分钟；(2)经尾静脉注射示踪剂(18F-FDG,由小型示踪剂加速器合成。注射剂量为0.11mci/kg);(3)休息40分钟：注射示踪剂后,正常对照组及模型组放置于鼠笼内,任由其自由活动35分钟,35分钟后把老鼠放置到气体麻醉箱内接受5分钟气体麻醉；足三里组及非穴组在注射示踪剂2分钟前接受穴位或非穴位针刺刺激,注射示踪剂过程中,不出针同时刺激,示踪剂注射(1分钟)后,继续进行针刺刺激7分钟,即整个针刺刺激过程约为10分钟,拔出针后,置大鼠于鼠笼内自由活动,约25分钟后放置于气体麻醉箱内接受5分钟气体麻醉。40分钟休息指的是,注射示踪后,所有动物休息约40分钟。(4)PET扫描：尾静脉注射18F-FDG显影剂40分钟后开始采集FDG PET头部显像图像,将大鼠置于micro PET下,扫描视野包括大鼠整个脑部及颈部,于SIEMENSE CAT EXACT HR+PET成像系统内,采用3D模式采集图像,通过滤波反投影法重建冠状面、横断面、矢状面断层图像进行分析,图像矩阵大小为128x128x63,图像存储格式为ANALYZE7.5。第二部分PET扫描：以上4组60只大鼠经24小时饥饿后,于早上8点之前送达中国人民解放军301医院PET实验动物中心,后按以下顺序开展工作：(1)在暗室内放置20分钟；(2)经尾静脉注射示踪剂(18F]FDG,由小型示踪剂加速器合成。注射剂量为0.11mci/kg);(3)休息40分钟：注射示踪剂后,放置于鼠笼内,任由其自由活动35分钟,35分钟后把老鼠放置到气体麻醉箱内接受5分钟气体麻醉；(4)PET扫描：尾静脉注射18F-FDG显影剂40分钟后开始采集FDGPET头部显像图像,将大鼠置于micro PET下,扫描视野包括大鼠整个脑部及颈部,于SIEMENSE CAT EXACT HR+PET成像系统内,采用3D模式采集图像,通过滤波反投影法重建冠状面、横断面、矢状面断层图像进行分析,图像矩阵大小为128×128×63,图像存储格式为ANALYZE7.5。图像后处理及分析：PET扫描图像后处理由中国科学院高能物理研究所负责,采用基于Matlab平台的像素统计分析软件-SPM2,对数据经过标准化、预处理后,剔除了变形图像(非穴组一例头动严重剔除),最后用于统计建模分析的各组大鼠样本数为：正常组15例,模型组15例,非穴组15例,足三里组15例；各组数据对比分析均采用两个独立样本t检验,uncorrected,置信度水平p<0.001,cluster大小取阈值为大于100个像素,对结果脑区的解剖学定位的方法,参照大鼠脑立体定位图谱,将激活脑区坐标换算到图谱坐标,同时加视觉观察判断。结果：第一次PET扫描结果：与正常组相比,模型组示葡萄糖代谢降低的脑区为右顶叶及左纹状体；升高的脑区主要位于边缘系统；与模型组相比,非穴组葡萄糖代谢升高的脑区为：右侧边缘系统(隔区),右侧额叶(额眶部皮质)；左胼胝体,左伏隔核,左侧边缘系统(隔区),左纹状体。与模型组相关,足三里组示葡萄糖代谢升高的脑区为：右侧边缘系统(黎状皮质),右颞叶(嗅皮质),右杏仁核,右海马区；左边缘系统(梨状皮质),左颞叶(嗅皮质)。与非穴组相比,足三里组示葡萄糖代谢升高的脑区为：右杏仁核,左颞叶(嗅皮质),左杏仁核。第二次PET扫描结果：组间比较结果：与正常组相比,模型组激活的脑区为：右侧脑桥：被盖,右侧延髓,左前叶,左中脑被盖,左延髓；与模型组相比,正常组激活的为：右侧内囊,右背侧丘脑核团,左侧胼胝体,左侧边缘系统：中隔,第三脑室；与模型组相比,非穴组激活的脑区：左侧枕叶：视觉皮质区；与非穴组相比,模型组激活的脑区：左侧颞叶：嗅觉皮质区,左侧海马；与模型组相比,足三里激活的脑区为：右背侧丘脑：外侧核团,右中脑背盖；与非穴组相比,足三里组激活的脑区为：右腺垂体；与足三里组相比,非穴组激活的脑区为：左侧嗅球区,左枕叶视觉皮质区。同组治疗后较治疗前激活的脑区：正常组治疗后-治疗前激活的脑区：右顶叶.感觉皮质；模型组治疗后-治疗前：右额叶：缘前皮质,右额叶：运动皮质,右枕叶：视觉皮质,右边缘系统：压后皮质,右边缘系统：压后皮质,右胼胝体,右连续系统：扣带回,右侧海马,右中脑：被盖,右中脑：顶前区,左额叶：运动皮质,左枕叶：视觉皮质区,左边缘系统：压后部,左胼胝体,左顶叶：感觉皮质区,左边缘系统：扣带回,左纹状体,左侧海马,左海马：齿状回,左腺垂体,左中脑：丘脑上部,左中脑：丘脑下部；非穴组治疗后-治疗前激活的脑区：右嗅球,右额叶：缘前皮质,右额叶：运动皮质,右枕叶：视觉皮质,右边缘系统：压后皮质,右胼胝体,右顶叶：感觉区,右边缘系统：扣带回区,右海马区,右腺垂体,右中脑：上丘脑,右中脑：下丘脑,右中脑：被盖,右中脑：导水管黑质,左枕叶：视觉区,左边缘系统：压部后皮质,左胼胝体,左顶叶：感觉区,左边缘系统：扣回带区,左海马区；足三里组治疗后-治疗前激活的脑区：右额叶：缘前皮质,右额叶：运动皮质,右颞叶：嗅觉皮质,右枕叶：视觉皮质,右边缘系统,右胼胝体,右顶叶：感觉皮质,右边缘系统：扣带回,右海马,右腺垂体,右中脑：丘脑上部,右中脑：丘脑下部,右中脑：被盖,右桥脑：被盖,左额叶：缘前皮质,左额叶运动皮质,左颞叶：听觉皮质,左颞叶：嗅觉皮质,左枕叶：视觉皮质,左边缘系统：压后部,左胼胝体,左顶叶：感觉皮质,左边缘系统：扣带回,左纹状体,左背侧丘脑：背侧核团,左海马,左脑垂体,左中脑：丘脑上部左中脑：丘脑下部,左脑桥：被盖。迷宫数据结果：经过重复测量方差分析可知,不同时间点的学习能力和记忆水平存在显著的差异,不同组别与不同时间点之间存在交互作用,即在不同组别在不同的时间点上也存在显著的差异。进一步进行单组的重复测量方差分析,可知每组的不同时间点的学习能力和记忆水平存在显著的差异。正常组中,第一天和第二天的值没有显著差异,但是显著高于第3天、第4天、第31天的值。模型组中,第一天的值显著高于后面几天的值,第31天的值与第2、3、4天的值没有显著的差异。其中非穴组中,第一天的值显著高于后面几天的值,第31天的值显著低于前三天的值。足三里组中,第一天的值显著高于后面几天的值,第31天的值显著低于前面几天的值。同时对每个时间点进行单因素方差分析可知不同组别之间存在显著的差异。进一步经过多重比较可知,在第1、2、3、4、31天,正常组的数值均显著低于其他三组；另外在第31天,模型组的数值又显著高于其他组。结论：腹腔注射D-gal联合基底核注射IBC,是一种可行的AD造模方法,PET成像示顶叶葡萄糖代谢降低,此为AD PET特征征象,可用于协助AD的早期诊断；针刺非穴及足三里均有脑区的激活；针刺足三里集中在边缘系统及颞叶,其中对颞叶的激活,与治疗AD密切相关；疗程后,PET显示,经过针刺足三里治疗一段时间后,海马区、隔区、第三脑室等脑区有不同程度的激活,发挥治疗效应；Y迷宫结果提示：针刺足三里,能够有效改善AD模型大鼠记忆水平,而针刺非穴,也有一定的治疗作用。推测为非穴点的定位比较接近足三里所致。