团头鲂低氧应答相关基因的功能及其对鳃重塑的影响

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团头鲂是我国重要的食草性淡水养殖经济鱼类,广受中国人民的喜爱并已成功被大规模推广养殖。与其他鲤科养殖鱼类相比,团头鲂具有不耐低氧的特点。而水体的溶氧含量易受到天气状况(如高温、暴雨)影响,气温升高,水体溶氧就会相应降低。在实际大规模集约化养殖过程中,高温、缺氧等环境因子常常制约着团头鲂的生长与生存,严重制约了它的养殖效益,给养殖产业带来了巨大的损失。因此,团头鲂对氧含量变化敏感这个短板,一直是我们研究攻克的重点,而鳃是鱼类重要的呼吸器官,是低氧研究的重要组织。为探索低氧应答相关分子机制,本研究以HIF-1α、HIF-2α、TET1三个低氧调控相关基因为研究目标,以团头鲂F5代幼鱼为主要研究对象,以团头鳃为重点研究组织,探究了团头鲂TET1的功能结构、胚胎各时期的时空表达模式,在急性低氧应激条件下胚胎、幼鱼各组织中的差异表达;以及HIF-1α、HIF-2α、TET1在响应温度、低氧胁迫时的不同表达模式及其对鳃重塑的影响。为研究团头鲂低氧调控分子机制提供基础的数据参考。主要研究结果如下:(1)TET1(ten eleven translocation 1)是一种5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)羟基化酶,参与低氧反应并在低氧应答过程有着重要作用。为了研究团头鲂TET1的结构功能及其表达特性,我们首先克隆了团头鲂TET1基因,通过序列分析、蛋白二级结构预测、构建进化树等基础生物信息学分析,了解团头鲂TET1基因的序列结构特点;采用整胚原位杂交、q RT-PCR技术进行了胚胎、组织表达分析及其在急性低氧胁迫下的基因响应研究。序列分析结果表明,团头鲂TET1基因全长为5526bp,编码1841个氨基酸;主要包含一个催化结构域和一个DNA结合结构域。q RT-PCR结果表明,团头鲂TET1广泛表达于各个组织中,并在脑组织中高度表达。在胚胎发育过程中,TET1基因从受精卵开始就有表达,胚胎发育过程表达有一定的波动性,并在受精后20-44h(20-44 hpf)都维持在一个较高水平,受精后36h表达量达到最大值。原位杂交结果表明,TET1基因在受精卵发育早期(12hpf)检测到相对微弱的信号,在发育中、后期(24和36hpf)信号逐渐增强,并且都集中在于头部表达。通过q RT-PCR检测急性缺氧处理TET1的表达量,结果表明,TET1基因在鳃、脾等组织中表达显著升高(P<0.01),在脑、皮肤、眼和肾脏中表达显著降低(P<0.01)。在胚胎中,TET1基因相对表达量明显高于对照组,尤其在24hpf低氧处理组的表达量显著的高于对照组(P<0.001)。以上结果表明TET1基因参与团头鲂胚胎发育过程与低氧胁迫响应,进而增强其对低氧的适应性。(2)为了研究温度及低氧这两个重要的环境因子对团头鲂HIF-1α、HIF-2α、TET1基因的表达影响及鳃重塑的影响。我们首先设置两个温度(25℃、10℃),采用q RT-PCR、组织切片技术进行了组织表达分析及鳃组织形态观察研究。q RT-PCR检测结果表明,在鳃组织中常氧下不同温度HIF-1α、HIF-2α表达没有明显差异,与常温25℃相比,TET1在低温10℃表达显著增加;在其他组织中,检测到温度对常氧下脑、肾组织中TET1的表达无明显影响,在心、肝、脾组织中,与25℃常温组相比,10℃低温组的表达量显著上调。鳃组织切片观察结果显示,与常温25℃相比,10℃低温对照组相邻鳃小片间的层间细胞团(ILCM)显著增多(P<0.01);同样,检测到暴露出的鳃小片厚度也显著增加。随后我们分别在两个温度(25℃、10℃)下设置持续24h的低氧实验,研究不同温度下低氧胁迫对团头鲂鳃组织形态及对HIF-1α、HIF-2α、TET1基因的表达影响。结果表明低氧诱导了团头鲂的鳃重塑;相同低氧胁迫时间,低温下(10℃)鳃小片暴露的相对较少,ILCM含量增多。鳃组织中,低氧处理12、24h对HIF-1α表达水平仍无明显影响,但对HIF-2α、TET1的表达却有显著影响;在其他组织中,检测到无论常温25℃还是低温10℃低氧胁迫12、24h后,TET1基因在心、肝、脾组织中均极显著的上调(P<0.01);脑、肾仅在低温10℃时表达量上调。以上结果表明,团头鲂TET1基因低氧的响应时间和程度不同,并且组织表达具有特异性;团头鲂鳃组织中HIF-2α可能比HIF-1α在低氧应答过程中更加活跃;团头鲂有通过改变鳃结构而调整呼吸表面积,以应对水温、溶氧变化的能力。(3)为了进一步研究鳃组织中HIF-1α、HIF-2α、TET1在低氧应答中的作用,我们在温度10℃条件下用硼替佐米对处于低氧胁迫的团头鲂幼鱼进行挽救处理。采用q RT-PCR、组织切片、扫描电镜技术进行鳃组织表达分析及鳃组织形态观察研究。组织切片、扫描电镜结果显示硼替佐米消除了低氧诱导的鳃小片(ILCM)层间细胞团的减少,抑制了缺氧诱导的鳃小片暴露长度及相邻鳃小片间距的增加;q RT-PCR结果显示硼替佐米下调了HIF-1α的表达,硼替佐米亦抑制了缺氧诱导的HIF-2α、TET1的增加(P<0.01),HIF-2α、TET1的表达量几乎下调到常氧下的水平。综上,推测团头鲂缺氧诱导的ILCM减少依赖于HIF-2α途径。本研究弥补了团头鲂TET1基因低氧应答研究的空白,为研究鳃重塑调控机制提供新的参考依据。
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