背景泛素-蛋白酶体（Ubiquitin-proteasome pathway,UPP）是哺乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系,参与和调控细胞的增殖、分化和凋亡。蛋白酶体主要由20S催化颗粒和19S调节颗粒两部分组成,其活性状态对维持细胞的正常功能起重要作用。蛋白酶体抑制剂可通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞功能,尤其对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用。蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib,velcade）是近年研究较多的一种蛋白酶体抑制剂,目前已被较广泛地应用于多种恶性肿瘤特别是多发性骨髓瘤的治疗。除了直接诱导肿瘤细胞凋亡外,硼替佐米尚可提高肿瘤细胞对自然杀伤（natural killer,NK）细胞杀伤的敏感性。然而,近年来研究发现硼替佐米对免疫细胞如T细胞和树突细胞有一定的毒性作用,如诱导活化的T细胞凋亡,抑制树突细胞活化T细胞的功能等。NK细胞是先天免疫细胞,在抗感染和抗肿瘤免疫中起着致关重要的作用。目前,有关硼替佐米对NK细胞功能调节作用的研究甚少。目的研究蛋白酶体抑制剂硼替佐米对正常人外周血NK细胞活性和功能的影响,探讨硼替佐米诱导NK细胞凋亡机制;观察联合应用硼替佐米与IL-12对多发性骨髓瘤SCID鼠皮下移植瘤生长及体内NK细胞杀伤活性的影响,研究IL-12与硼替佐米协同抗肿瘤作用以及IL-12抵抗硼替佐米对NK细胞的毒性作用。方法1.体外研究硼替佐米对人外周血自然杀伤细胞活性和功能的影响1.1硼替佐米对人外周血淋巴细胞或LAK细胞活性的影响:采用淋巴细胞分离液分离正常人外周血单个核细胞,去除贴壁细胞后获取悬浮细胞即外周血淋巴细胞（PBLs）。体外应用白介素-2（IL-2）诱导PBLs 72h产生淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞。将PBLs、LAK细胞进行体外培养,给予不同浓度的硼替佐米处理12、24、48h,采用AnnexinV（AV）和propidium iodide（PI）双标进行流式细胞术检测细胞凋亡情况。1.2硼替佐米对人外周血自然杀伤细胞活性和功能的影响:采用NK细胞阴性选择试剂盒分离纯化正常人NK细胞,流式细胞术检测NK纯度,将NK细胞进行体外培养,给予不同浓度的硼替佐米处理12、24h,或联合应用GSH（氧自由基清除剂）或zVAD（全Caspase抑制剂）预处理,AV和PI双标进行流式细胞术检测细胞凋亡;荧光测定半胱天冬酶caspase-3活性的变化;Mitotracker Red荧光染色法测定线粒体膜电位的改变;细胞内染色法检测穿孔素的表达;细胞表面染色检测NK细胞膜活化性受体的表达;分别以K562细胞和P815细胞作为靶细胞采用标准的4h⁵¹Cr释放试验检测NK细胞的细胞毒作用或杀伤功能。2.硼替佐米对骨髓瘤小鼠自然杀伤细胞活性和功能的影响2.1建立SCID鼠多发性骨髓瘤皮下移植瘤模型:对数生长期的RPMI 8226细胞,调整细胞数至1×10⁸/ml,取0.1 ml含10⁷个细胞接种于5-6周龄雌性SCID鼠前肢处背部皮下。14d后实体瘤长至直径大于0.5cm时进行药物干预。2.2荷瘤小鼠体内注射NS、硼替佐米和/或IL-12抑瘤效果观察、NK细胞数变化及脾细胞杀伤功能SCID鼠皮下成瘤后随机分成NS组、IL-12组（0.4ug/只）、硼替佐米组（0.75mg/kg）和硼替佐米+IL-12序贯治疗组,分别给予腹腔注射IL-12,尾静脉注射硼替佐米和NS,观察荷瘤小鼠瘤体的生长抑制情况;干预前后取外周血做血常规及流式检测NK细胞比例,末期取脾细胞悬液做LDH释放实验检测NK细胞的杀伤功能。结果:1.体外研究硼替佐米对人外周血自然杀伤细胞活性和功能的影响1.1硼替佐米诱导PBLs和LAK细胞凋亡流式检测结果显示:硼替佐米明显诱导PBLs凋亡,细胞凋亡率随药物浓度和作用时间增加而升高;低剂量硼替佐米（4.7ng/ml）处理PBLs细胞12h后,PBLs部分发生凋亡,作用48h后,超过80%的PBLs出现调亡。硼替佐米同样以时间和剂量依赖方式诱导LAK细胞凋亡。1.2硼替佐米诱导NK细胞凋亡,并抑制其杀伤活性。此研究中所用NK细胞的纯度均在90%以上。硼替佐米以时间-剂量依赖方式显著诱导NK细胞凋亡,4.7ng/ml和18.8ng/ml硼替佐米处理NK细胞12h、24h后细胞的总凋亡率显著升高。18.8ng/ml硼替佐米处理NK细胞12h、24h,凋亡率明显高于4.7ng/ml组,二者比较差异有显著性统计学意义（12h时P＜0.01,24h时P＜0.001）,呈剂量依赖关系。同样浓度硼替佐米（4.7ng/ml或18.8ng/ml）处理NK细胞,24h细胞凋亡率明显高于12h处理组（P＜0.0001）,呈时间依赖关系。为进一步研究其诱导NK细胞凋亡的机制,我们检测了Caspase-3活性。结果表明硼替佐米诱导NK细胞Caspase-3活性增高,硼替佐米（18.8ng/ml）处理24h的NK细胞其Caspase-3活性较未处理组升高了约4倍。有趣的是GSH（氧自由基清除剂）或zVAD（全Caspase抑制剂）预处理完全阻断了Caspase-3的活化,同时发现GSH预处理组细胞24h的早期和总凋亡率较硼替佐米（4.7ng/ml）单用组明显下降（P＜0.05）,然而zVAD预处理组细胞的总凋亡率未显著减少,这一发现提示Caspase-3的活化是ROS（reactive oxygen species活性氧簇）依赖机制。为进一步确定线粒体在硼替佐米诱导的NK细胞凋亡中的作用,我们利用Mitotracker Red标记结合流式细胞仪技术检测了线粒体膜电位的变化,结果显示4.7ng/ml、18.8ng/ml硼替佐米处理NK细胞12h、24h后,Mitotracker Red的平均荧光强度明显低于未处理组（P＜0.01）。GSH预处理有效的阻止了大部分线粒体膜电位的耗散。相反,zVAD无线粒体膜电位的保护作用,提示硼替佐米诱导NK细胞凋亡机制中线粒体膜电位的耗散早于caspase-3的活化,同时说明ROS介导的线粒体损伤在硼替佐米诱导的NK细胞凋亡机制中起重要作用。NK细胞内穿孔素及NK细胞膜表面活化性受体的表达方面的研究结果显示:对照组与硼替佐米处理组NK细胞内穿孔素的表达以及活化性受体（NKG2D、NKp30、DNAM-1）表达水平无明显差异。然而,硼替佐米显著抑制了NKp46的表达,其抑制作用与使用的药物剂量成依赖关系。此外,Bay-11阻断NF-κB活性后NKp46表达水平降低,提示NF-κB可能参与了NKp46的表达调节,硼替佐米所诱导的NKp46的表达下调部分是通过其阻断NF-κB活性的功能实现的。NKp46是重要的NK细胞活化性受体之一,为了研究NKp46表达的下调对NK细胞杀伤功能的影响,我们采用铬51释放试验检测NK细胞的重向细胞毒作用。结果显示:低剂量硼替佐米（4.7ng/ml）处理NK细胞12小时后,在anti-NKp46抗体存在的条件下NK细胞对P815细胞的杀伤作用明显下降。同对照组比较,在效靶比20:1和10:1时,二者之间的杀伤水平有显著差异。Bay-11也同样抑制了NK细胞裂解P815细胞的能力。然而,硼替佐米并未影响NK细胞对K562细胞的杀伤能力,提示硼替佐米特异性、选择性地干扰NKp46活化途径介导的NK细胞杀伤作用。2.硼替佐米对骨髓瘤小鼠体内自然杀伤细胞活性和功能影响2.1 44只SCID鼠皮下移植RPMI 8226细胞后2周均达到成瘤标准,NS和IL-12治疗组小鼠皮下肿瘤以时间依赖方式生长,虽IL-12治疗组肿瘤生长轻微受抑,相比NS组,二者无显著差异。而硼替佐米治疗组及硼替佐米联合IL-12治疗组小鼠肿瘤生长明显受到抑制,肿瘤体积明显缩小（P＜0.01）。硼替佐米单用组荷瘤小鼠瘤体显著减少,但停止应用硼替佐米后,观察到小鼠肿瘤再生长。为明确是否IL-12具有协同硼替佐米的抗肿瘤效应,给予IL-12序贯治疗结果显示,同药物单用组比较,硼替佐米联合IL-12治疗导致肿瘤再生长延迟,并且瘤体继续缩小。提示IL-12联合硼替佐米治疗较单药组有更强的抗肿瘤效果。IL-12可增加硼替佐米抗瘤效应,二者联合有协同作用。硼替佐米抗骨髓瘤同时是否会影响荷瘤小鼠体内NK细胞的数量和功能,治疗前后取外周血做血常规及流式染色检测结果显示:硼替佐米处理组治疗后NK细胞数明显低于治疗前（P＜0.01）,联合IL-12序贯治疗后NK细胞数仍低于治疗前,此结果提示硼替佐米在体内具有抑制NK细胞增殖和或诱导NK细胞凋亡的作用。NS组、IL-12组治疗前后NK细胞数无明显变化。LDH释放实验检测显示经硼替佐米治疗后的荷瘤小鼠NK细胞杀伤靶细胞的功能明显低于NS组和IL-12单用组（P＜0.01）,联合IL-12序贯治疗后其杀伤活性显著提高。这提示IL-12虽不能阻止NK细胞数量的减少,但对硼替佐米治疗所造成的NK细胞杀伤功能缺陷具有保护作用。结论1.硼替佐米主要过ROS依赖及非依赖机制造成线粒体膜电位的耗散,导致人PBLs、LAK细胞、NK细胞凋亡。2.硼替佐米可以降低静止期NK细胞表面NKp46的表达,并抑制NKp46活化途径所介导的NK细胞杀伤功能。3.硼替佐米可减少骨髓瘤小鼠体内NK细胞数,影响其杀伤功能,联合IL-12治疗有协同抗肿瘤作用,同时可部分解救硼替佐米对NK细胞的毒性作用。