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断奶仔猪腹泻和水肿病是导致断奶仔猪死亡的重要传染性疾病,对养猪业造成了巨大的经济损失,E.coli F18菌株是引起这两种疾病的主要病原菌。由于中国地方猪种抗E. coliF18分子机制尚不清楚,本研究从microRNA及其靶基因的调控作用入手,首先基于课题组前期在苏太猪(具有太湖猪和杜洛克血统的培育品种)F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体microRNA测序筛选出的重要的]microRNA-miR-192,利用靶基因预测、qPCR、双荧光素酶报告检测、细胞水平的细菌感染刺激、TALEN敲除以及microRNA前体SNP检测等一系列基因功能验证技术,系统分析miR-192及其靶基因的作用,以期进一步揭示microRNAs在断奶仔猪F18大肠杆菌抗性的调控机制。主要试验结果如下：(1)一种高效准确的大肠杆菌对肠上皮细胞黏附水平的检测方法有助于大肠杆菌抗性相关miRNA及其靶基因的功能研究,本研究应用实时荧光定量PCR方法,以大肠杆菌F18ab、F18ac和K88ac菌毛蛋白基因和猪β-ACTIN基因设计定量PCR引物,以大肠杆菌和猪肠上皮细胞系(IPEC-J2)总DNA为模板进行相对定量PCR检测,利用2-△△Ct计算不同细胞培养面积孔板中细菌相对细胞黏附数量。结果显示,6孔板、12孔板和24孔板培养面积的猪肠上皮细胞分别对F18ab、F18ac口K88ac大肠杆菌的相对黏附数量均差异不显著,大肠杆菌相对黏附数量不受细胞培养数量的影响,结果表明所建立的方法能够准确检测大肠杆菌相对黏附数量,为本研究中大肠杆菌黏附相关实验提供了便捷可靠的检测方法。(2)miR-192靶基因的生物信息分析结合前期表达谱芯片结果,获得5个重要的靶基因,分别是DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3,结合基因生物学功能和文献挖掘的结果,将ALCAM和DLG5基因确定为关键靶基因进行相关功能研究。通过构建关键靶基因非编码区的荧光素酶报告重组载体,与miRNA模拟物(mimics)共转染293细胞,在细胞水平分析验证miR-192对于关键靶基因的靶向作用,荧光素酶活性检测结果显示,miR-192 mimics对ALCAM和DLG5基因均表现为抑制作用(P<0.05)。(3)关键靶基因ALCAM和DLG5的表达谱分析结果表明,DLG5基因在苏太猪35日龄断奶仔猪抗性型和敏感型个体的空肠、十二指肠、肝脏、肺、肾等组织中高度表达,抗性型个体的相对表达量高于敏感型个体,且在心脏和淋巴组织中达到显著水平(P<0.05),在所有组织中抗性型和敏感型个体表达水平的差异倍数为1,04%6,464；ALCAM基因在苏太猪的肝脏、肺、肾组织中高度表达,在胃、淋巴、十二指肠和空肠组织中度表达,在其他组织中表达量相对较低,且抗性型和敏感型个体各组织组间差异均不显著。在苏太猪从初生到断奶不同发育时期(8日龄、18日龄、28目龄和35日龄)的表达差异分析结果表明,DLG5基因在肌肉、肺脏及免疫(胸腺、淋巴和脾脏)等组织中随日龄增加表达降低,十二指肠和空肠组织中在28日龄的表达量降至最低,35日龄时呈上升趋势。ALCAM基因28日龄肾脏组织中表达量显著高于8日龄(P<0.05)；28日龄和35日龄十二指肠组织的表达量显著低于18日龄,呈下调趋势(P<0.05)。(4)在猪小肠上皮细胞系IPEC-J2中分析F18ab、F18ac和K88ac侵袭对miR-192及其关键靶基因表达的影响,细菌刺激未对miR-192的转录水平产生显著影响,细菌培养上清刺激也没有引起miR-192转录水平的显著变化,且不随刺激时间表现出变化趋势；细菌刺激引起了DLG5和ALCAM基因转录水平显著下调(P<0.05),细菌培养上清刺激也能引起DLG5和ALCAM基因转录水平下调,且随着刺激时间的延长,DLG5和ALCAM基因的转录水平表达呈显著下调趋势(P<0.05)。(5)利用TALEN载体介导敲除IPEC-J2细胞miR-192成熟体,获得miR-192成熟体序列缺失的细胞株,对细胞株中重要靶基因表达水平的检测结果表明,miR-192敲除细胞和对照组的DLG5、ALCAM, FRMD4B的表达水平差异不显著,而MIPOL1和ZFHX3在敲除细胞中的表达水平表现为显著下调(P<0.05),大肠杆菌黏附水平检测结果显示,miR-192敲除细胞对大肠杆菌F18ab、F18ac和K88ac的黏附能力均表现为显著上升(P<0.05)。鉴于苏太猪同时具有外来品种和中国地方猪品种的遗传基础,关于苏太猪microRNAs的研究并不能完全代表和揭示中国地方猪品种断奶仔猪F18大肠杆菌抗性的调控机制。因此,本研究又以中国地方猪品种梅山猪为研究对象,利用E. coli F18菌株对梅山断奶仔猪进行大肠杆菌感染试验,并通过细菌数量检测、小肠上皮细胞体外黏附及病理检测等一系列试验对大肠杆菌感染试验的表型结果进行系统的验证,获得了确证的E.coli F18抗性型和敏感型个体,然后利用Selex高通量测序,筛选梅山猪断奶仔猪抗性型和敏感型个体间差异microRNAs,通过靶基因预测、网络互作图构建等生物信息学手段,结合课题组前期转录组测序结果,筛选出重要的靶基因及其调控通路,同时利用RNAi技术和细菌感染在细胞水平上进一步验证重要靶基因及其通路基因对大肠杆菌感染的调控作用,探讨中国地方断奶仔猪F18大肠杆菌抗性相关的microRNA分子及其关键靶基因的功能及其调控机制。主要试验结果如下：(1)对苏太猪中发挥重要调控作用的miR-192在梅山猪中进行初步的功能分析验证,组织表达谱结果显示,miR-192在十二指肠和空肠组织中均具有较高水平的表达,肝和肾中度表达,在心、脾、肺、胃、肌肉、胸腺和淋巴中表达量较低。结合前期梅山猪断奶仔猪大肠杆菌试验的结果,大肠杆菌处理没有造成十二指肠和空肠组织中miR-192表达水平的显著性变化,miR-192可能并没有在梅山猪断奶仔猪大肠杆菌感染过程中发挥重要的调控作用。(2)利用前期通过大肠杆菌感染试验和一系列验证获得的确证的梅山猪断奶仔猪大肠杆菌抗性型和敏感型全同胞个体,对其十二指肠组织进行microRNA高通量测序分析,获得梅山猪抗性型和敏感型全同胞个体差异miRNAs 24个,其中上调15个,下调9个；通过qPCR方法检测验证miRNAs的差异倍数,发现其与高通量筛选结果具有较高的一致性；结合课题组前期梅山猪断奶仔猪大肠杆菌抗性型和敏感型全同胞个体的转录组结果以及差异miRNAs的实验验证结果,并通过靶基因互作网络的分析,将miR-7136-5p及其靶基因MyD88基因确定为关键microRNA和关键靶基因,鉴于MyD88是TLRs/IL-1R信号通路中重要的接头蛋白,将其所在TLR4信号通路作为本试验重点研究的关键调控通路,分析其在大肠杆菌感染中的作用及其机制。(3)F18ac和K88ac菌体刺激后,猪小肠上皮细胞系IPEC-J2的MyD88转录水平显著下调,其所在的TLR4通路中TNFa基因转录水平极显著上调(P<0.01)。细菌培养液上清刺激后,MyD88基因在8小时后急剧下调,：TNFa基因转录水平显著上调(P<0.05)。受大肠杆菌F18ac和K88ac刺激后,PK15细胞的MyD88同样显著下调(P<0.05); F18ac使TLR4通路中CD14基因的表达极显著上调(P<0.01),而K88ac的刺激未显著改变其表达;IFN-a表达变化不显著,K88ac刺激使TLR4通路中IL-1β和TLR4基因轻度上调,jTNF-a基因水平极显著上调(P<0.01)。细菌培养上清液同样使PK15细胞MyD88基因整体表现下调；CD14基因整体为下调；IFN-a表现为下调；IL-1β和TLR4基因整体趋势为上调；F18ac上清处理组TNF-a表现为极显著水平的上调(P<0.01),而K88ac上清处理组TNF-a未表现出上调趋势。(4)利用RNAi技术获得干扰猪MyD88基因效率最高的shRNA表达载体,将其包装成慢病毒载体,用于建立MyD88基因稳定沉默的细胞系,最终获得MyD88基因的干扰效率分别为69.3%、61.0%的IPEC-J2和PK15细胞。MyD88基因的下调造成PK15细胞TLR4和1L-1β基因表达水平显著下调(P<0.05),而CD14、IFN-a和TNF-a基因表达水平未发生显著变化。RNAi MyD88基因未对细胞培养液上清中细胞因子IL-1β和TNF-a的水平造成显著影响。(5)MyD88基因稳定沉默的PK15细胞系受大肠杆菌F18ac和K88ac刺激后,MyD88基因仍表现为下调表达,并且干扰组PK15细胞的TLR4和IL-1β基因变化趋势大于对照组；CD14基因变化趋势小于对照组,TNF-a基因变化趋势与对照组相似,IFN-a表现出了显著下调的变化(P<0.05)。受大肠杆菌培养上清刺激后,干扰组PK15细胞的TLR4、CD14、 MyD88、IL-1β、IFN-a变化趋势与对照组相似,而干扰组PK15的TNF-a变化趋势小于对照组。对细胞培养液中细胞因子IL-1β和TNF-a检测结果显示,大肠杆菌F18ac和K88ac菌体刺激均使IL-1β水平极显著增高(P<0.01),且干扰组上调趋势大于对照组；K88ac培养上清液刺激使IL-1β显著增高(P<0.05),且干扰组和对照组趋势相似。F18ac和K88ac菌体和培养上清液刺激均未对干扰组细胞培养液中TNF-a水平产生显著影响。本研究结果表明,microRNA在苏太猪和梅山猪断奶仔猪大肠杆菌感染过程中均发挥了重要的调控作用,而且进一步提示梅山猪(中国地方猪品种)和苏太猪(含有外来猪品种血统的培育品种)在大肠杆菌病抗性的遗传基础和调控机制方面确实存在差异。miR-192靶向作用DLG5和ALCAM基因在苏太猪断奶仔猪应对大肠杆菌侵袭、维持肠道稳定、免疫调控等方面发挥了重要的调控作用, miR-7136-5p靶向作用MyD88基因进而影响TLR4通路在梅山猪断奶仔猪应对大肠杆菌侵袭和免疫应答等方面发挥了重要的调控作用。