研究背景及目的急性肺损伤(Aucte lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是常见的临床危重症,是由心源性以外的各种肺内外致病因素(严重感染、休克、创伤、烧伤和吸入有害气体等)造成弥漫性的肺间质、肺泡水肿和肺部急性炎症。临床表现为呼吸窘迫和顽固性的低氧血症等。ALI/ARDS进展迅速,可转变成为多脏器功能衰竭,预后差,病死率高。ALI/ARDS确切发病机制尚不完全清楚,可能与炎性介质、氧化应激产物、肺泡上皮和血管内皮损伤、凋亡等多种因素有关。大量炎性介质和细胞因子导致肺微血管通透性增加、肺泡Ⅱ型上皮细胞受损,表面活性物质生成减少,加上水肿液稀释作用,表面活性物质含量更低,肺表面张力增大、肺的顺应性降低,肺泡塌陷和有效通气面积减少,通气／血流比例严重失调,形成进行性的低氧血症。目前研究发现,抗炎、抗氧化是有力的保护措施,对ALI/ARDS患者早期给予抗炎等综合治疗,有助于炎症的消退和肺功能的改善。因此,在ALI/ARDS的治疗策略方面,及时有效的抗炎、抗氧化治疗,对提高肺组织的氧合能力,纠正低氧血症、改善肺功能等有重要意义。转录因子NF-E2相关因子(NF-E2-related factor2, Nrf2)是细胞抗氧化反应的中枢调节者,是细胞氧化应激反应中的关键因子,Nrf2通过与抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)相互作用,在抗炎、抗氧化机制中具有重要作用。多种刺激或药物能诱导Nrf2过表达,Nrf2/ARE信号通路激活后,调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶表达,主要有血红素加氧酶(HO-1)、硫氧还蛋白(Trx)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、环氧化物水解酶(EH)、磺基转移酶(SULT)、乙醛基转移酶、乙醛脱氢酶(ALDH)、醌氧化还原酶(NQO1)、葡糖醛酸转移酶(UGT)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、谷胱甘肽合成酶等,它们能清除体内多种致癌物质或其他毒性及氧化性物质,减少对DNA及生物功能蛋白破坏,以维持机体内环境的稳定。NF-κB属于Rel蛋白家族,是一种普遍存在的诱导型核转录因子,细胞受到外界刺激后,NF-κB从胞质进人细胞核,与DNA链上特异的部位结合,调控基因转录。NF-κB调控多种细胞因子、黏附分子和炎性介质,如TNF-α、IL-1β、 IL-6、iNOS、COX-2、ICAM-1等。NF-κB过度激活可引起炎症介质大量合成、释放,导致炎症瀑布效应,加快ALI及ARDS的进程。促炎症因子(TNF-α, IL-1β)是机体应激后产生最早、并起到核心作用的炎症介质,通过增强炎症细胞活性,产生活性氧,血小板活化因子等,引起炎性损伤；炎症介质过度释放及氧化应激产物增多,与ALI/ARDS发生、发展密切相关。ICAM-1是一种免疫球蛋白超家族细胞间粘附分子,表达于内皮细胞、淋巴细胞,介导单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及激活内皮细胞。ICAM-1参与免疫、炎症及肿瘤转移等一系列重要生理和病理过程。研究发现ICAM-1介导的白细胞与内皮细胞粘附是白细胞聚集、活化和释放炎性介质的关键,加重炎症级联反应,在ALI中起着重要作用。依布硒林(Ebs),化学名为2-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮,是一类小分子有机硒化合物。在对有机硒化合物研究中,最初发现它们具有毒性小且稳定的特点,随后在对其活性的测试中发现,此类物质还具有增强组织抗氧化能力,抗肿瘤及抗微生物等活性,引起了研究人员的极大兴趣。Ebs是目前公认具有模拟谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)作用最好的药物之一,Ebs在抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化,治疗心肌和脑缺血以及免疫调节等方面有显著的效果,特别是在多种因素诱导的肺损伤模型中,Ebs均显示出强大的保护作用。多种疾病模型中,Ebs能够诱导Nrf2及其下游基因HO-1和Trx表达,但未见Ebs对静脉注射LPS诱导的内毒素性急性肺损伤的研究报道。本研究通过观察Nrf2在内毒素性肺损伤中动态表达,了解其在ALI中的作用。探讨Ebs是否可以通过调控Nrf2,进而诱导下游抗炎、抗氧化基因表达,发挥保护作用,为临床防治急性肺损伤提供一个新的思路和方法。第一章内毒素性急性肺损伤模型建立及Nrf2的表达目的建立内毒素性急性肺损伤模型,观察Nrf2、炎症因子及氧化应激产物的动态表达,探讨机体对内毒素刺激的应答机制。方法将36只体重180-220g的SD雄性大鼠随机分为两组：正常对照组(n=18)和模型组(n=18),模型组尾静脉注射LPS (5mg/kg),而正常对照组尾静脉注射相应的生理盐水。分别于造模后6h、24h、72h分批放血处死动物后,各组各时间点均取6只动物,收集血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。观察和比较各组各个时间点动脉血气、肺干湿比、BALF中蛋白含量、肺组织病理,血中炎症因子(TNF-α、IL-1β)、肺组织中氧化应激产物(MDA、SOD、MPO)及抗氧化转录因子Nrf2表达。采用析因设计方差分析进行比较后,再进行多重比较。取P<0.05为差异有统计学意义。结果1.各组大鼠Pa02变化：时间和组别不存在交互效应(F=2.253,P=0.123),C组三个时间点,Pa02介于(91.10±3.55)mmHg至(93.27±3.45)mmHg,三组比较,统计学无差异(F=0.756,P=0.487),而LPS组三个时间点有增高趋势,介于(72.60±6.20)mmHg至(78.93±5.03)mmHg,但差异仍无统计学意义(F=1.702,P=0.218)。LPS组从T1时开始,大鼠Pa02均较对照组同一时间点的数值低,且组间差异有统计学意义(T1、T2时P均0.000,T3时P=0.001)。2.各组大鼠PaCO2变化：时间和组别不存在交互效应(F=2.566,P=0.094),C组三个时间点,PaCO2介于(45.82±3.21)mmHg至(46.58±4.05)mmHg,各时间点比较,未见统计学差异(F=0.358,P=0.705),而LPS组有降低趋势,介于(57.67±2.55)mmHg和(53.37±3.80)mmHg之间,差异无统计学意义(F=3.988,P=0.051)。LPS组从T1时开始,大鼠PaCO2均较对照组同一时间点的数值要高,且组间差异有统计学意义(T1时P=0.000、T2时P=0.002,T3时P=0.024)。3.各组大鼠肺湿重／干重比(W/D):时间和组别不存在交互效应(F=0.819,P=0.451),C组各时间介于(3.88±0.17)至(4.11±0.27)。各个时间点比较,未见统计学差异(F=1.153,P=0.252),而LPS组介于(5.35±0.26)至(5.11±0.34),有降低趋势,但差异仍无统计学意义(F=1.014,P=0.383)。LPS组从T1时开始,大鼠W/D均较对照组同一时间点的数值要高,且组间差异有统计学意义(T1、T2、T3时P均0.000)。4.各组大鼠BALF中蛋白；时间和组别不存在交互效应(F=2.573,P=0.094)。C组各时间点介于(186.19±23.86)mg/L至(192.77±28.58)mg/L,各个时间点比较,未见统计学差异(F=0.101,P=0.906),而LPS组介于(378.43±32.75)mg/L至(321.97±31.44)mg/L,有降低趋势,T3明显低于T1,差异有统计学意义(F=4.503,P=0.031)。LPS组从T1时开始,大鼠BALF中蛋白均较对照组同一时间点的数值要高,且组间差异有统计学意义(T1、T2、T3时P均0.000)。5.各组大鼠肺组织病理学改变：光镜下可见各组三个时间点肺组织病理改变较小,C组肺组织结构清晰,肺泡腔无炎性细胞浸润,肺泡壁薄,间质血管无扩张,支气管粘膜上皮完整。LPS组肺泡结构受到广泛破坏,肺组织水肿及肺间质明显的增宽,肺泡腔内有浆液性渗出,可见大量红细胞以及中性粒细胞。6.各组大鼠肺组织MDA表达：时间和组别不存在交互效应(F=2.755,P=0.080)。C组各时间点MDA介于(7.01±2.52)nmol/mg至(7.44±2.10)nmol/mg;各个时间点比较,未见统计学差异(F=0.048,P=0.954),而LPS组介于(26.47±4.80)nmol/mg至(19.36±3.68)nmol/mg,有降低趋势,但差异无统计学意义(F=3.112,P=0.076)。LPS组从T1时开始,大鼠肺组织MDA均较对照组同一时间点的数值要高,且组间差异有统计学意义(T1、T3时P均0.000,T2时P=0.003)。7.各组大鼠肺组织SOD活性：时间和组别不存在交互效应(F=2.864,P=0.073)。C组各时间点肺组织SOD活性介于(193.07±17.39)U/mg至(203.60±16.89)U/mg,各时间点比较,未见统计学差异(F=0.657,P=0.533)。而LPS组介于(93.08±12.53)U/mg至(115.70±13.64)U/mg,随时间推移逐渐升高,差异有统计学意义(F=4.211,P=0.037)。LPS组从T1时开始,大鼠肺组织SOD均较对照组同一时间点的数值低,且组间差异有统计学意义(T1、T2、T3时P均0.000)。8.各组大鼠肺组织MPO活性：时间和组别不存在交互效应(F=1.713,P=0.198)。C组各时间点肺组织MPO介于(2.17±0.52)U/g至(2.02±0.78)U/g;各个时间点之间差异未见未见统计学差异(F=0.091,P=0.914)。LPS组介于(7.78±1.59)U/g至(6.30±1.03)U/g,有降低趋势,但差异无统计学意义(F=1.686,P=0.221)。LPS组从T1时开始,大鼠肺组织MPO均较对照组同一时间点的数值高,且组间差异有统计学意义(T1、T2、T3时P均0.000)。9.各组大鼠血清TNF-α表达：时间和组别存在交互效应(F=4.909,P=0.015)。C组各时间点血清TNF-α介于(93.43±20.69)pg/ml至(90.53±19.99)pg/ml,各个时间点比较,未见统计学差异(F=0.031,P=0.970),而LPS组介于(379.05±41.85)pg/ml至(298.95±39.52)pg/ml,有降低趋势,T3明显低于T1,差异有统计学意义(F=6.554,P=0.010)。LPS组从T1时开始,大鼠血清中TNF-α均较对照组同一时间点的数值高,且组间差异有统计学意义(T1、T2、T3时P均0.000)。10.各组大鼠血清IL-1β表达：时间和组别不存在交互效应(F=3.284,P=0.052)。C组各时间点血清IL-1β介于(81.76±20.43)pg/ml至(74.23±20.10)pg/ml,未见统计学差异(F=0.239,P=0.790),而LPS组介于(344.89±46.94)pg/ml至(270.38±41.71)pg/ml,有降低趋势,T3明显低于T1,差异有统计学意义(F=4.046,P=0.041)。LPS组从T1时开始,大鼠血清中IL-1β均较对照组同一时间点的数值高,且组间差异有统计学意义(T1、T2、T3时P均0.000)。11.各组大鼠肺组织Nrf2相对表达量比较：时间和组别不存在交互效应(F=2.682,P=0.109)。C组各时间点未见统计学差异(F=0.273,P=0.770),而LPS组T2时达到高峰,但三个时间点差异无统计学意义(F=2.114,P=0.202)。LPS组从T1时开始,大鼠肺组织Nrf2均较对照组同一时间点的数值高,且组间差异有统计学意义(T1时P=0.013,T2时P=0.011、T3时P=0.025)。结论5mg/kg的LPS尾静脉注射能够导致大鼠6h、24h、72h三个时间点氧合障碍、肺部间质水肿、氧化应激和炎症反应增加,以6h时最明显；并且能激活体内的抗氧化系统,使Nrf2表达增多,但随时间变化不明显。可见本研究采用5mg/kg的LPS能够成功制备ALI大鼠模型。该研究可为以后研究提供ALI动物模型。第二章依布硒啉对内毒素性急性肺损伤保护作用及机制目的通过建立内毒素性急性肺损伤模型,观察依布硒啉对内毒素性急性肺损伤炎症因子和氧化应激影响,通过研究抗氧化转录因子Nrf2及其下游的抗氧化基因HO-1和Trx-1,以及NF-κB、ICAM-1等,阐明依布硒啉对内毒素性肺损伤保护作用分子机制。方法将48只体重180-220g的SD雄性大鼠随机分为6组(每组8只)：正常对照组(C组)、模型组(LPS)、依布硒啉低剂量组(EbsL组)、中剂量组(EbsM组)、高剂量组(EbsH组)和地塞米松组(DEX组)。LPS组：尾静脉注射LPS5mg/kg+腹腔注射溶剂；EbsL组：尾静脉注射LPS5mg/kg+腹腔注射依布硒啉7.5mg/kg; EbsM组：尾静脉注射LPS5mg/kg+腹腔注射依布硒啉15mg/kg; EbsH组：尾静脉注射LPS5mg/kg+腹腔注射依布硒啉30mg/kg; DEX组：尾静脉注射LPS5mg/kg+腹腔注射地塞米松5mg/kg; C组：尾静脉注射等量生理盐水+腹腔注射溶剂。分别于造模后6h,分批放血处死动物。收集血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。观察和比较各组动脉血气、肺干湿比、BALF中蛋白含量、肺组织病理,肺组织中氧化应激和炎症因子、抗氧化基因(HO-1、Trx-1)和转录因子(Nrf2、NF-κB)及粘附分子ICAM-1的表达。结果1.各组大鼠Pa02的变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=15.517,P=0.000)。LPS组较对照组降低,组间差异有统计学意义(P=0.000)；而EbsL组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P=0.060);EbsM组、EbsH组、Dex组均较LPS组高,组间差异均有统计学意义(P分别为0.041、0.003、0.000)。Ebs抑制急性肺损伤大鼠动脉Pa02降低。2.各组大鼠PaCO2的变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=13.815,P=0.000)。LPS组较对照组升高,组间差异有统计学意义(P=0.000)；而EbsL组、EbsM组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P分别为0.332、0.070)；EbsH组、Dex组均较LPS组降低,组间差异均有统计学意义(P均=0.000)。Ebs改善大鼠急性肺损伤造成血氧交换障碍。3.各组大鼠肺组织湿重／干重(W/D)的变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=17.862,P=0.000)。LPS组较对照组升高,组间差异有统计学意义(P=0.000)；而EbsL组、EbsM组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P分别为0.336、0.087)；EbsH组、Dex组均较LPS组降低,组间差异均有统计学意义(P分别为0.003、0.000)。Ebs减轻急性肺损伤大鼠肺湿干重比,表明Ebs可以减轻大鼠急性肺损伤造成的肺水肿。4.各组大鼠BALF中蛋白含量改变：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=53.602,P=0.000)。LPS组较对照组升高,组间差异有统计学意义(P=0.000)；而EbsL组、EbsM组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P分别为0.246、0.066)；EbsH组、Dex组均较LPS组降低,组间差异均有统计学意义(P均=0.000)。Ebs减轻ALI大鼠BALF中蛋白含量,表明Ebs可以减轻大鼠ALI造成的肺血管通透性增加。5.各组大鼠病理改变：光镜下可见C组肺泡结构清晰,肺泡壁薄,肺泡壁与间质内无炎性细胞浸润。LPS组血管周围间隙增宽,肺间隔增宽,可见大量红细胞以及中性粒细胞,部分肺间隔变薄、断裂,肺泡腔内可见出血、炎症细胞及液体渗出。EbsL、EbsM组肺泡结构部分被破坏,肺间隔增宽,肺泡腔内有多量渗出的红细胞及炎性细胞浸润。EbsH组、DEX组肺泡结构保持相对完整,肺间隔稍增宽,肺泡腔内红细胞及炎性细胞的浸润明显减少。6.各组大鼠肺组织MDA变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=7.149,P=0.000)。LPS组较对照组升高,组间差异有统计学意义(P=0.000); EbsM组、EbsH组、Dex组均较LPS组降低,组间差异均有统计学意义(P分别为0.027、0.009、0.001)；而EbsL组、组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P=0.187)。Ebs的应用可降低ALI大鼠肺组织MDA含量,表明Ebs可以减少大鼠内毒素性ALI氧自由基产生,减轻肺组织氧化应激损伤。7.各组大鼠肺组织SOD变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=13.064,P=0.000)。LPS组较对照组降低,组间差异有统计学意义(P=0.000); EbsM组、EbsH组、Dex组均较LPS组升高,组间差异均有统计学意义(P分别为0.010、0.001、0.000)；而EbsL组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P=0.275)。Ebs的应用可增加ALI大鼠肺组织SOD含量,表明Ebs可以抑制大鼠内毒素性ALI造成的抗氧化酶降低,改善肺组织氧化应激。8.各组大鼠肺组织MPO变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=8.947,P=0.000)。LPS组较对照组升高,组间差异有统计学意义(P=0.000);、EbsH组、Dex组均较LPS组降低,组间差异均有统计学意义(P分别为0.013、0.001)；而EbsM组、EbsL组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P分别为0.158、0.059)。Ebs可降低ALI大鼠肺组织MPO含量,Ebs抑制内毒素性ALI肺组织中性粒细胞在肺组织聚集。9.各组大鼠肺组织TNF-α变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F--43.971,P=0.000)。LPS组较对照组升高,组间差异有统计学意义(P=0.000)；EbsM组、EbsH组、Dex组均较LPS组降低,组间差异均有统计学意义(P分别为0.001、0.000、0.000)；而EbsL组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P=0.118)。Ebs的应用可降低ALI大鼠肺组织TNF-α含量,表明Ebs减轻内毒素性ALI大鼠肺组织促炎症介质TNF-α,抑制炎症反应发展。10.各组大鼠肺组织IL-1β变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=61.297,P=0.000)。LPS组较对照组升高,组间差异有统计学意义(P=0.000)；EbsH组、Dex组均较LPS组降低,组间差异均有统计学意义(P分别为0.002、0.000)；而EbsM组、EbsL组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P分别为0.262、0.059)。Ebs可降低ALI大鼠肺组织IL-1β含量,表明Ebs减轻内毒素性ALI大鼠肺组织促炎症介质IL-1β,起到抗炎作用。11.各组大鼠肺组织Trx-1蛋白表达变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=58.187,P=0.000)。LPS组较对照组增高,组间差异有统计学意义(P=0.047)；而EbsM组、EbsH组均较LPS组升高,组间差异均有统计学意义(P分别为0.022、0.045)；、EbsL组与LPS比较,组间差异无统计学意义(P分别为0.945)。Ebs的应用可增加ALI大鼠肺组织Trx-1含量,表明Ebs能诱导内毒素性ALI大鼠肺组织抗氧化因子Trx-1表达,抑制氧化应激和炎症反应。12.各组大鼠肺组织HO-1蛋白表达变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=126.725,P=0.000)。LPS组较对照组增高,组间差异有统计学意义(P=0.019);而EbsL组、EbsM组、EbsH组均较LPS组增高,组间差异均有统计学意义(P均为0.000)。Ebs明显增加ALI大鼠肺组织HO-1含量,表明Ebs能通过调节抗氧化因子表达的水平改善肺内氧化应激和炎症反应。13.各组大鼠肺组织ICAM-1蛋白表达变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=101.524,P=0.000)。LPS组较对照组增高,组间差异有统计学意义(P=0.000)；而EbsL组、EbsM组、EbsH组均较LPS组明显降低,组间差异均有统计学意义(P分别为0.021、0.000、0.000)。表明Ebs明显降低内毒素性ALI大鼠肺组织ICAM-1表达,抑制炎症反应发展。14.各组肺组织Nrf2蛋白表达变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=91.602,P=0.000)。LPS组较对照组增高,组间差异有统计学意义(P=0.034)；而EbsL组、EbsM组、EbsH组均较LPS组增高,组间差异均有统计学意义(P分别为0.001、0.000、0.000)。表明Ebs明显诱导内毒素性ALI大鼠肺组织Nrf2表达,增加机体抗炎、抗氧化能力。15.各组肺组织NF-κB蛋白表达变化：采用One-way ANOVA检验,各组间差异有统计学意义(F=46.037,P=0.000)。LPS组较对照组增高,组间差异有统计学意义(P=0.000)；而EbsL组、EbsM组、EbsH组均较LPS组降低,组间差异均有统计学意义(P分别为0.011、0.000、0.000)。表明Ebs抑制内毒素性ALI大鼠肺组织NF-κB磷酸化,减轻炎症反应。结论Ebs对内毒素性ALI有保护作用,可能与诱导肺组织Nrf2生成,增强Trx-1和HO-1的表达,抑制肺组织NF-κB的激活,降低氧化应激产物MDA、MPO及炎症因子TNF-α、IL-1β的释放以及ICAM-1粘附分子的产生,最终减轻肺组织的损伤。