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干细胞具有自我更新能力及多向分化潜能,在疾病治疗中具有巨大的潜在应用价值,例如可以治疗心血管疾病、神经系统疾病和自身免疫性疾病等。干细胞的临床应用首先需要有足够的细胞量,但人体组织中的干细胞数量非常少,因此需要进行体外扩增,而干细胞在体外培养环境中极易分化,所以在体外大量扩增的同时维持其未分化状态是目前亟需解决的问题。Nanog是干细胞维持自我更新和多能性的关键因子,在干细胞未分化状态的维持中发挥着重要作用。本研究以Nanog的启动子为靶点,筛选能够激活Nanog启动子的小分子化合物,然后对目标化合物在干细胞干性维持中的作用及促进Nanog基因表达的机制进行探究。1.Nanog表达激活剂的筛选及鉴定为了筛选能够维持干细胞特性的化合物,我们将本实验室前期已制备的p GL3-Nanogp质粒转染到HEK293细胞中,建立以Nanog启动子为靶点的荧光素酶报告基因筛选模型,之后将化合物加入细胞培养体系中,通过检测其对荧光素酶活性的影响筛选可激活Nanog启动子的化合物。利用此筛选模型对本实验室购买的480种FDA批准的上市药物进行初步筛选和复筛,然后用目标化合物分别刺激P19细胞,通过半定量RT-PCR和Western blot方法在m RNA和蛋白水平对目标化合物的活性进行鉴定。结果显示,化合物A4-46、A6-55和A6-72能够激活Nanog启动子,且在m RNA和蛋白水平均能促进Nanog的表达。2.目标化合物在P19细胞干性维持中的作用为了检测化合物A4-46、A6-55和A6-72在干性维持中的作用,我们首先用目标化合物处理P19细胞,48h后提取蛋白并通过Western blot方法检测其它干性因子Oct4和Sox2的表达水平。结果显示,化合物A4-46、A6-55和A6-72均能够上调Oct4和Sox2的表达。之后我们又通过类胚体形成实验检测了目标化合物对P19细胞干性的影响。将P19细胞进行悬浮培养,4d后得到类胚体,对其进行碱性磷酸酶染色并计数。结果显示,化合物A6-55和A6-72处理组细胞能够形成更多的类胚体,且形成的类胚体高表达碱性磷酸酶,与对照组相比在统计学上具有显著性差异,而化合物A4-46处理组类胚体数目则没有变化。为了进一步检测类胚体形成前期细胞团中干性因子Oct4、Sox2和Nanog的表达情况,对细胞团进行免疫荧光染色及Western blot分析,结果显示化合物A6-55和A6-72处理组三种干性因子的表达水平相对较高,而化合物A4-46处理组与对照组相比几乎没有区别。以上实验表明,化合物A6-55和A6-72能够促进P19细胞的干性维持,而化合物A4-46则无此功能,因此在后续的研究中排除了化合物A4-46。本实验室前期已经筛选获得促进Oct4表达的天然小分子化合物T2-78,所以我们考虑将促进Nanog表达的化合物A6-55和A6-72分别与促进Oct4表达的化合物T2-78联合应用处理P19细胞,通过检测类胚体形成能力和干性因子的表达情况分析两种化合物联合之后对P19细胞干性维持的影响。结果发现,化合物联合处理组细胞形成类胚体数目及干性因子Nanog、Oct4、Sox2的表达均得到进一步提升,提示促进Nanog表达的化合物A6-55和A6-72分别与促进Oct4表达的化合物T2-78联合能够进一步促进P19细胞干性的维持。之后我们通过裸鼠畸胎瘤实验进一步检测了目标化合物对P19细胞多潜能性的影响,将P19细胞用目标化合物处理7d,之后对裸鼠进行皮下注射,待畸胎瘤形成后对其体积和重量进行测量,并且通过Western blot检测AFP（内胚层标志物）、c Tn T（中胚层标志物）和β3-tublin（外胚层标志物）三个胚层标志物的表达情况,发现A6-72与T2-78联合处理组畸胎瘤的重量增加,且在统计学上具有显著性;Western blot结果显示,A6-72处理组的畸胎瘤中AFP、c Tn T和β3-tublin的表达均高于对照组,A6-72与T2-78联合处理组三胚层标志物的表达量更高。以上结果说明,化合物A6-72能够促进P19细胞的多潜能性,A6-72与T2-78联合处理的情况下效果更好。3.利用Oct4-GFP小鼠胚胎干细胞鉴定目标化合物对干细胞的影响由于P19细胞不是真正意义上的干细胞,所以需要用干细胞对化合物A6-55和A6-72的活性进行鉴定,此处所用细胞系为来源于Oct4-GFP转基因OG2小鼠的胚胎干细胞（OG2-m ES细胞）。分别用化合物A6-55和A6-72处理OG2-m ES细胞,以加DMSO组为对照,在处理第6天分析细胞的形态和GFP表达情况。结果显示,化合物A6-55和A6-72能够维持紧密集落形态和OG2-m ES细胞中的GFP表达,提示化合物A6-55和A6-72能够促进干细胞的干性维持。4.目标化合物促进Nanog基因表达的分子机制研究为了阐明化合物A6-55和A6-72促进Nanog基因表达的分子机制,我们用目标化合物处理P19细胞,分别在处理15min、30min和60min后提取蛋白并利用Western blot方法检测干细胞干性相关信号通路NF-κB、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin的变化。发现化合物A6-55可以增加P19细胞细胞质中的p-IκB水平并促进p50和p65入核,对NF-κB信号通路有激活作用,而NF-κB信号通路抑制剂PDTC则可以逆转A6-55的促Nanog表达作用,提示化合物A6-55通过激活NF-κB信号通路来促进Nanog基因的表达。化合物A6-72同样可以激活NF-κB信号通路,且可以使细胞中的p-Akt水平上升,激活PI3K/Akt信号通路,而NF-κB信号通路抑制剂PDTC和PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002均可以逆转A6-72的促Nanog表达作用,提示化合物A6-72可通过激活NF-κB信号通路和PI3K/Akt信号通路来促进Nanog基因的表达。综上所述,本研究以Nanog的启动子为靶点,筛选出2种能够促进Nanog基因表达且促进干细胞干性维持的小分子化合物,并以Wnt/β-catenin、PI3K/Akt和NF-κB信号为切入点对其作用机制进行了初步探究。本研究不仅为Nanog基因的表达调控奠定了实验基础,同时也为胚胎干细胞干性的维持提供了新的线索。