【摘 要】
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脂肪是猪的重要经济性状之一,研究表明细胞中的脂质储存在“脂滴”这种细胞器中。脂滴近似球形,由中性脂质核心和表面的单层磷脂膜构成,其数量和大小决定了细胞的脂质含量。脂滴的生成和变大受到多种因素的影响,比如营养状态、激素水平和氧化应激等。前期本课题组分离了猪谷胱甘肽S转移酶mu2（GSTM2）基因,发现第5外显子存在C27T的转换（CGA→TGA）,导致转录本发生无义介导的m RNA降解。本研究中进一
【基金项目】
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中央高校基本科研业务费专项资金资助项目； 国家转基因重大专项； 湖北省农业科技创新中心畜禽遗传改良及健康养殖技术团队项目；
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脂肪是猪的重要经济性状之一,研究表明细胞中的脂质储存在“脂滴”这种细胞器中。脂滴近似球形,由中性脂质核心和表面的单层磷脂膜构成,其数量和大小决定了细胞的脂质含量。脂滴的生成和变大受到多种因素的影响,比如营养状态、激素水平和氧化应激等。前期本课题组分离了猪谷胱甘肽S转移酶mu2（GSTM2）基因,发现第5外显子存在C27T的转换（CGA→TGA）,导致转录本发生无义介导的m RNA降解。本研究中进一步分析GSTM2基因功能,发现干涉GSTM2的细胞中脂滴数量明显增加。通过构建基因敲除小鼠,发现GSTM2缺失导致小鼠肝脏和骨骼肌中脂质含量增加。通过高脂饲喂、组织形态学检测、免疫共沉淀联合免疫印迹检测、信号通路分析、激光共聚焦检测、活细胞工作站观察等方法揭示了GSTM2调控细胞脂滴含量的分子机制。主要研究结果如下:1.GSTM2通过ASK1-p38-JNK信号通路调节Hep G2细胞脂滴含量。（1）抑制GSTM2表达导致细胞中脂滴含量增加。使用RNAi干涉细胞中GSTM2,BODIPY493/503标记脂滴,荧光显微镜检测显示,干涉组细胞中脂滴明显增多。取GSTM2敲除小鼠的骨骼肌和肝脏组织进行油红O染色分析,结果表明GSTM2敲除的组织中脂质含量明显增加。（2）GSTM2敲除小鼠高脂饲喂后肝脏脂质含量更高、积累更快。分别使用高脂饲料和胆碱-蛋氨酸缺乏饮食饲料饲喂小鼠,取肝脏组织进行HE和油红O染色,并对甘油三酯含量进行检测,结果表明GSTM2敲除小鼠的肝细胞中脂质含量更高,累积速度更快;此外,GSTM2敲除小鼠肝脏纤维化水平更高。（3）GSTM2与ASK1结合进而调节p38-JNK信号通路。在细胞中干涉GSTM2后ASK1磷酸化水平升高,p38-JNK信号被激活;过表达GSTM2抑制ASK1磷酸化,抑制p38-JNK信号。免疫共沉淀实验表明GSTM2与ASK1相互结合,进一步通过蛋白截短实验发现GSTM2通过C端与ASK1结合。（4）GSTM2通过激活ASK1-p38-JNK信号通路促进脂滴生成和生长。使用棕榈酸和Selonsertib（GS-4997）分别激活和抑制ASK1活性,SREBP1和PLIN2等脂质合成基因表达水平升高,并且GPAT4和DGAT2在脂滴表面的定位增加,从而促进脂滴的生成和生长。此外,GSTM2调控PCYT1A表达,影响脂滴表面的磷脂酰胆碱合成速率,从而影响脂滴的表面张力调节脂滴的生长。（5）过表达GSTM2抑制高脂饲喂诱导的肝脏脂肪积累。将GSTM2过表达载体与活体转染试混合,注射到小鼠腹腔,每周一次持续一个月,期间进行高脂饲喂,取肝脏组织进行HE和油红O检测,结果表明过表达组的肝脏脂质含量明显低于对照组。此外,过表达组肝脏组织的纤维化水平也明显降低。（6）抑制ASK1-p38-JNK信号通路降低了GSTM2敲除小鼠肝脏的脂肪含量。使用Selonsertib进行活体注射,每周一次持续一个月,取肝脏组织进行HE和油红O检测,结果表明GSTM2敲除小鼠肝脏组织中的脂肪含量明显下降。2.GSTM2通过降低细胞中ROS水平调节细胞脂滴含量。（1）GSTM2调节细胞中ROS水平。使用RNAi干涉GSTM2表达,检测发现ROS水平升高;而过表达GSTM2可以降低ROS含量。（2）ROS通过促进PLIN2表达调节细胞中脂滴含量。使用过氧化氢处理细胞,脂滴数量增多,且不随处理浓度增加而变化。检测脂滴相关基因表达发现PLIN2表达水平显著升高（P<0.05）。过表达PLIN2后细胞中脂滴数量增加;而干涉PLIN2表达导致细胞中脂滴含量下降,并且降低PLIN2表达可以抑制过氧化氢诱导的细胞脂滴含量增加。对过氧化氢处理后0-7小时PLIN2表达以及脂滴数量进行分析,发现PLIN2从2小时开始表达增加（P<0.05）,脂滴从3小时30分钟开始增加（P<0.05）。（3）降低ROS水平可以抑制GSTM2干涉导致的脂滴增多。细胞中干涉GSTM2后外源添加乙酰半胱氨酸,检测发现ROS水平显著下降（P<0.05）,并且脂滴数量也明显下降。上述试验结果表明,GSTM2的蛋白N端发挥GST转移酶功能,降低细胞中ROS水平,抑制ROS诱导的脂滴含量增加;蛋白C端可以结合并抑制ASK1磷酸化,抑制下游p38-JNK信号的激活,调节脂质合成相关基因的表达和定位。本研究解析了GSTM2调控细胞脂滴含量的分子机制,发现II相解毒酶在细胞脂质代谢中发挥潜在作用,为后续细胞脂质生成和沉积相关研究提供了新思路。
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