论文部分内容阅读
目的：探索一种高效提取骨胶原的方法，并制备骨胶原凝胶用于种子细胞双相接种法构建组织工程骨，观察构建的效果；试制循环灌注式三维组织培养装置用于组织工程骨培养，以提高其传质效率；应用循环灌注式三维组织培养装置培养双相接种法构建的组织工程骨，观察双相接种技术与灌注培养在组织工程骨构建中相结合的效果。 方法：1、设计增强酶解法从猪皮质骨中提取骨胶原，通过大体观察、计算提取率、氨基酸成分分析、分子量测定等指标对骨胶原进行鉴定，应用倒置显微镜和组织学方法观察骨髓间充质干细胞在骨胶原凝胶中的生长、分布情况；2、试制出循环灌注式三维组织培养装置，然后对其流量、恒温效果、无菌性能和气体交换效果进行检测，鉴定其作为组织培养平台的能力；3、应用自制骨胶原凝胶液和已建立的种子细胞双相接种法构建组织工程骨，分成二组：实验组应用循环灌注式三维组织培养装置进行灌注培养，对照组置于CO2孵箱中进行平皿培养，计算种子细胞上架率，大体、倒置显微镜及扫描电镜分别观察两组细胞形态、组织结构的不同；HE染色比较观察两组在组织结构和细胞在基质中分布情况方面的区别；测定碱性磷酸酶（ALP）活性、DNA含量和钙含量及骨钙素免疫组织化学染色，比较两种培养方法对MSCs增殖、分化的影响。 结果：1、增强酶降解法提取骨胶原可达到94.04％的提取率。骨胶原氨基酸组成中甘氨酸占35.6％，脯氨酸及羟脯氨酸占27.5％，最大光吸收波长为232nm。蛋白电泳结果显示，胶原凝胶液以单体α1和α2成分为主，含有一定量的二聚体和低聚体，其成分最低分子量为79000。电泳后产生清晰的5个条带，分别代表二种单体、二种二聚体和低聚体；2、骨胶原凝胶液粘度高，可在pH近中性环境中约10min固化，MSCs在骨胶原凝胶中呈三维均相分布，约2小时开始伸展，胶原凝胶发生收缩；3、试制了一种循环灌注式三维组织培养装置，在设定温度下，箱体内昼夜温差可控制在1℃以内。连续观察、检测在循环灌注式三维组织培养装置中循环三周的培养液无细菌生长。培养液循环流量可控制在0-87.5ml／min,根据理论推算，以DMEM／F12为培养介质，以脱钙骨基质为支架材料，可产生0-47.2dyne／cm2的流体剪切应力。组织工程骨