鱼类自主pogo转座子的挖掘、进化及活性验证

来源 :扬州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jimchenstong
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Tc1转座子超家族广泛分布于细菌、真菌及昆虫等各种生物中,有些Tc1转座子超家族成员已经被开发为重要的遗传育种操作工具,如SB转座子已经作为基因治疗和转基因的介导载体得到广泛应用。pogo转座子是Tc1转座子超家族的重要成员,但对其分布、进化和活性研究报道很少。本研究通过硬骨鱼转座组注释,并在脊椎动物中针对Tc1转座子超家族的重要成员pogo转座子进行分布、进化和活性研究,以挖掘活性pogo转座子,研发自主知识产权的遗传操作工具,为动物转基因和基因治疗等研究提供技术支撑。主要研究内容如下:  (1)通过生物信息学手段对9种硬骨鱼转座组进行注释。结果表明9种硬骨鱼类转座组大小和构成差异显著,其转座组含量从高到低分别为斑马鱼、矛尾鱼、青鳉鱼、花斑剑尾鱼、大西洋鳕鱼、三刺鱼、金娃娃、罗非鱼和红鳍东方纯,转座子含量和基因组大小呈正相关。DNA转座子在硬骨鱼类中具有多样性高和含量差异大的特点(0.50%-38.37%),是硬骨鱼类转座组差异的主要决定因素,其中hAT和Tc/Mariner超家族是硬骨鱼类主要的DNA转座子。RNA转座子在硬骨鱼类中也具有多样性高的特点,其中LINE转座子占硬骨鱼类基因组0.53%-5.66%,共检测到12个(I、CR1、L1、L2、R1、R2、Jockey、 RTE和Rex)超家族分布,其中L1、L2、RTE和Rex转座子扩增较为明显,LTR转座子除了在斑马鱼和三刺鱼中含量达到5.58%和2.51%,在大多硬骨鱼类基因组中的含量低于2%,在硬骨鱼类中共检测到6个LTR转座子(Copia、DIRS、ERV、Gypsy、 Ngaro和Pao)超家族分布,其中扩增最为明显的是Gypsy。而SINE转座子在硬骨鱼类中扩增最弱,仅在斑马鱼和矛尾鱼中分别达到3.28%和5.64%,在其它7个品种中低于1%。SINE中tRNA、5S和MIR三个超家族在部分硬骨鱼类中有一定程度扩增。本研究表明硬骨鱼类转座组具有多样性丰富、差异大的特点,转座组差异与硬骨鱼基因组大小有很强的相关,转座组是决定硬骨鱼基因组大小的重要因素。  (2)通过TBLAST程序对NCBI数据库中脊椎动物基因组比对发现pogo转座子主要分布在鱼类基因组中,其中在28个鱼物种中发现了pogo转座子的分布,在2种两栖动物(西方爪蛙和高山蛙)和4种爬行动物中发现了pogo转座子的分布,在鸟类和哺乳动物未能发现者典型的pogo转座子结构。pogo转座子在进化中衍生出POGK和POGZ功能基因,POGZ在脊椎动物中分布广泛,而POGK主要分布在哺乳动物中。POGK和POGZ功能基因含有保守的pogo转座酶DBD和DDE结构域,且DDE氨基酸残基高度保守,提示POGK和POGZ可能具有DNA酶活性。  (3)为验证人源POGK和POGZ在哺乳动物细胞上的活性,构建了pogo转座子介导的新霉素报告基因表达质粒pPG-PGK-NEO,及转座酶表达质粒pT2-CMV-POGK和pT2-CMV-POGZ,同时构建斑马鱼pogo转座酶表达质粒pT2-CMV-Pgase。将pPG-PGK-NEO与分别上述三个转座酶表达质粒共转染Hela细胞,通过G418筛选获得稳定表达Neo基因的阳性细胞,阳性细胞克隆数比较表明,pT2-CMV-POGK和pT2-CMV-POGZ组显著高于对照组,而pT2-CMV-Pgase组显著高于POGK、POGZ和对照组,提示pogo转座酶、POGK、POGZ基因均具有转座活性。  (4)为了进一步明确斑马鱼pogo转座酶PGase转座子时空表达特性,以PGase正、反义RNA为探针,对不同发育阶段的斑马鱼胚胎进行原位杂交,结果表明,PGase在胚胎早期发育各阶段具有表达活性,正向表达水平明显高于反向,且表达无明显组织特异性,  本研究表明,pogo转座子主要分布在鱼类、两栖类和爬行类动物中,具有较高的转座活性,且其衍生基因POGK和POGZ也具有转座活性。
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