猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究

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本研究取 26 天 WZSP 胚胎,成功构建、冷冻了五指山猪遗传资源成纤维细胞系,并且建立了良好的猪胎儿成纤维细胞培养体系及优化的转染方法,在此基础上猪胎儿成纤维细胞最高传代至 F26,pEGFP-N3 质粒转染率可达到 48%。根据建系要求,对 PEF的生物学性状进行分析得结果如下: 1.培养细胞形态为典型的成纤维状,可根据对胰蛋白酶的敏感度不同,将其纯化。 2.生长曲线结果表明,F2、F5、F10 猪胎儿成纤维细胞的生长曲线均呈“S”型,细胞经历了潜伏期、指数生长期和平台期。 3.细胞冷冻实验结果显示,猪胎儿成纤维细胞用 DMSO(10%)和甘油(10%)冷冻,细胞存活率分别为 76.93%和 81.74%,说明本研究中所采用冷冻保护剂和三步平衡法适合于 PEF 的长期冷冻保存。 4.染色体核型分析结果为 WZSP 的二倍体染色体数目为 2n=38,在本研究培育体系中能保持二倍体性状,遗传性状能稳定,可以使五指山猪遗传资源在细胞水平长久保持下来。 5.绿色荧光蛋白基因在培养细胞中的表达 Fugene-6 能有效介导 pEGFP-N3 质粒转染 PEF 细胞,转染率与细胞生长汇合程度,质粒 DNA 和脂质体的浓度比例、转染时间及 G418 浓度相关。本实验中当细胞汇合度达 50%~60%时,用 3.0μl 脂质体介导 1.0μg 质粒转染 8 h,用 G418(800μg/ml)筛选一周到两周即可获得较满意的转染效率,转染率可达到 48%。
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