论文部分内容阅读
肿瘤,是全球重要的公共卫生问题。全球每年肿瘤年发病率约为202.8／100,000,年死亡率约为127.9/100,000。全美国每4个死亡中就有一个是由肿瘤所引起。中国恶性肿瘤呈逐年上升趋势,目前已成为第一位死因。早在20世纪初,科学家就已经发现,染色体结构异常是肿瘤发病的关键因素。费城染色体的研究表明：染色体结构异常能引起基因表观遗传学改变,促进肿瘤发生、发展。拷贝数变异,包括扩增、缺失等,是染色体结构改变的重要组成部分。基于基因芯片的拷贝数变异检测,无法将拷贝数变异断点定位至碱基水平。为研究拷贝数变异可能带来表观遗传学改变,需要选择适当方法进行断点定位分析。本研究主要目的为：以染色体9p21大片段缺失为研究对象,以乳腺癌细胞系MCF-7和胰腺癌细胞系PANC-1为模板,探索缺失断点定位的实验方法,分析拷贝数变异对基因转录的影响。实验方法培养乳腺癌细胞系MCF-7和胰腺癌细胞系PANC-1,提取DNA及RNA。利用多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation-based Probe Amplification, MLPA),查明MCF-7和PANC-1细胞系中染色体9p21缺失情况,判断缺失位点可能区间,并用常规PCR加以确认。以MCF-7细胞系DNA为模板,探讨长片段PCR以及反向PCR进行缺失断点定位可行性,并明确MCF-7细胞系中9p21缺失断点准确位置。根据缺失断点定位信息,分析可能的基因转录子改变,运用cDNA快速扩增技术以及TA克隆测序,检测可能形成的新融合转录子。实验结果1、MLPA检测发现乳腺癌细胞系MCF-7和胰腺癌细胞系PANC-1中,均存在累及MTAP、CDKN2A等基因大片段缺失的情况。MCF-7细胞系的端粒侧断点位于MTAP基因内,着丝粒侧断点位于CDKN2A基因内；PANC-1细胞系染色体9p21大片段缺失的端粒侧缺失断点位于MTAP基因内,着丝粒侧的缺失断点因超出MLPA检测范围而未可知。2、长片段PCR以及反向PCR均证实,MCF-7细胞系9p21缺失位点位于chr9：21819532至chr9：21989622之间,缺失片段大小约为170kb;断点端粒侧位于MTAP基因的外显子4后,着丝粒侧位于CDKN2A (p14)基因的内含子1内近外显子1β处。3、在MCF-7细胞系中,检获到一个新MTAP转录融合子,由MTAP基因前4个外显子与非编码区chr9：22087143-22087648融合形成,含967个碱基、翻译125个氨基酸序列。在PANC-1细胞系中,检获到两个新MTAP转录融合子,其中一个与非编码区chr9：22384168-22384481融合,含876个碱基、翻译138个氨基酸序列；另外一个与非编码区chr9：22674440-22674564融合,含598个碱基、翻译149个氨基酸序列。实验结论MLPA技术是检测染色体9p21大片段缺失的有效方法,能准确判断大片段缺失边界范围,适合于aCGH检测后大样本筛查。乳腺癌细胞系MCF-7和胰腺癌细胞系PANC-1均存在着累及MTAP和CDKN2A基因大片段缺失。长片段PCR、反向PCR是缺失断点定位的良好方法,证实MCF-7细胞系中存在一个起于MTAP基因内、止于CDKN2A基因内、大小约为170kb的缺失片段。由于染色体9p21的缺失,乳腺癌细胞系MCF-7中存在一个缺失、融合形成新MTAP转录子；胰腺癌细胞系PANC-1中,存在两个缺失、融合形成新MTAP转录子。这些新MTAP转录融合子是否参与肿瘤发生、发展,还有待进一步研究。