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大螟Sesamia inferens (Walker)又名稻蛀茎夜蛾、紫螟。大螟广泛分布于东南亚产稻国家(菲律宾、越南、老挝、柬埔寨等)及南太平洋岛屿(巴布亚新几内亚等),在朝鲜、日本、印度等国家也有报到。过去的研究认为,大螟在我国的分布北限大致在北纬340的陕西周至、河南信阳、安徽合肥和江苏淮阴一线。随着全球气候变暖,大螟的分布北限也在逐渐向北扩展,己在北纬34。以北的稻区发生危害。大螟原为一种水稻上的常发次要害虫,然而在21世纪初,安徽、湖北、湖南、江苏、江西等省相继报道大螟种群数量迅速上升,对水稻的为害逐渐加重并成为水稻的主要害虫之一。本文从生理生态和分子生物学角度研究大螟对低温胁迫的响应,以便更好地了解大螟越冬阶段的行为特征,探讨大螟的耐寒性策略和对低温胁迫的响应机理,从而为掌握该虫的爆发成灾机理提供理论依据。主要研究结果如下：1、扬州地区越冬大螟的耐寒特性和策略越冬初期(2012年10月份)的大螟幼虫死亡率(M)与处理温度(T,[-12,-2])的关系符合关系式：M=0.9832e-0.0354(T+12)-0.0004(T+12)4。继而推算LTemp50=-6.119℃, LTemp90=-9.774℃。整个越冬期间大螟幼虫耐寒性呈现显著的季节性变化,在2013-1-30达到最高。但过冷却点变化不显著,平均过冷却点为-6.80℃。在2013年3月9日前,越冬大螟幼虫的含水量变化差异不显著,平均含水量为63.5%；之后随环境温度上升,含水量显著增加,达到约76%。小分子糖及多元醇(甘油、海藻糖、果糖、葡萄糖和肌醇)变化趋势相似,随着环境温度降低,在1月份含量上升到各自的最高峰,分别为甘油359.79μg/g、海藻糖20.46 mg/g、果糖69.78μg/g、葡萄糖377.25μg/g肌醇59.55 μg/g；随后又随着环境温度上升而下降。综合上述研究结果,初步推测扬州地区大螟的越冬耐寒策略为耐冻型。2、克隆了5个大螟热激蛋白基因采用RT-PCR和RACE技术,成功的从大螟中克隆得到5个热激蛋白基因,分别为Sihsp83、Sihsc70、Sihsp21.4、Sihsp20.6和Sihsp19.6。5个热激蛋白基因cDNA序列全长分别为2496、2160、1385、835和798 bp,开放阅读框长度分别为2154、1962、564、552和525 bp,分别编码717、653、187、183和174个氨基酸,推测分子量分别为82.6、71.6、19.6、20.6和19.6 kDa。序列分析发现5个热激蛋白与其他物种具有很高的相似性,都具有各自家族的典型结构域。亚细胞定位分析结果表明HSP83和HSC70位于细胞质。在HSP21.4、HSP20.6和HSP19.6氨基酸序列中各发现1个HSP20家族典型基序。通过比对基因组序列和cDNA序列发现,Sihsp83、Sihsp20.6和Sihsp19.6均不含有内含子；Sihsc70含有2个内含子,长度分别为685 bp和803 bp。前者位于61-745 bp(基因组序列),编码区上游,紧挨着编码区；后者位于954-1756 bp(基因组序列),编码区内；Sihspl.4含有1个内含子,1210 bp,位于472-1681 bp,基因编码区内。所有内含子的基因组剪切位点符合经典的GT-AG规则。系统进化分析显示,与相近物种的热激蛋白具有很高的同源性。3、大螟内参基因的筛选研究通过RT-RCR技术克隆了7个大螟看家基因的部分片段,包括18S rRNA、EF1、GAPDH、 RPS13、RPS20、TUB和ACTB。利用qRT-PCR技术研究了7个看家基因在大螟不同组织(头部、体壁、脂肪体、前肠、中肠、后肠、血淋巴、马氏管和唾腺),不同生长发育阶段(卵、1-6龄、雌蛹、雄蛹、雌成虫和雄成虫)以及不同温度处理(-8℃、-6℃、-4℃、-2℃、0℃和27℃)实验条件下的表达稳定性。运用常用的内参基因筛选程序(NormFinder、 geNorm和BestKeeper)以及比较ACt法对各看家基因进行了排名,经过RefFinder综合评估后,得出了最佳的内参方案。不同组织内参组合：jPS13、RPS20和EFl;不同发育阶段内参组合：18S rRNA、EF1和GAPDH;不同温度处理内参组合：18S rRNA、RPS20和TUB。4、大螟5个热激蛋白基因的表达模式采用Real-time PCR研究了5个大螟热激蛋白基因在大螟不同组织(头部、体壁、脂肪体、前肠、中肠、后肠、血淋巴、马氏管和唾腺)、不同生长发育阶段(卵、1-6龄、雌蛹、雄蛹、雌成虫和雄成虫)以及不同温度处理(-8℃、-6℃、-4℃、-2℃、0℃和27℃)下的表达模式。结果表明,5种热激蛋白基因在上述实验条件下均有表达。在不同组织中,Sihsp83和Sihsp19.6在后肠中的表达量最高；Sihsp20.6在前肠中的表达量最高；Sihsp21.4在头部中的表达量最高；Sihsc70在各组织中的表达量差异不显著。在大螟不同生长发育阶段中,Sihsp21.4在雌成虫体内表达最高；其余4种热激蛋白基因在卵中均有很高的表达。5龄幼虫经过低温处理后,5种热激蛋白基因均有上调表达的趋势。上述研究结果表明,热激蛋白参与了大螟的生长发育,而且其耐寒性的增加与3个小分子热激蛋白的上调表达有关。