重金属作为生产生活中的重要原材料,来源广泛、难以降解,可以随着食物链、食物网累积,对生命体具有重要毒害作用。其中,铜是一种常见的重金属元素,痕量Cu2+可以促进生物体的生长发育,但是重金属Cu2+在体内的浓度超过一定的限度就会威胁生物体正常的生命活动。草履虫在水体环境中十分常见,具有成型的细胞核、细胞比表面积大、世代时间短、细胞器结构较为完整,常被作为模式生物研究细胞对环境胁迫物质的响应,在生态毒理学实验中有着重要作用。研究重金属胁迫下草履虫相关差异基因,可以为揭示重金属铜的体内转运、吸附和代谢通路奠定实验基础,为进一步深入研究原生动物对重金属离子的耐受和抗逆机制提供数据支持。本研究以一种草履虫作为受试生物,研究了在不同作用时间(24 h、96 h),不同作用浓度(0.01 mg/L、0.02 mg/L)下重金属Cu2+胁迫对其转录表达的影响,通过对实验组和对照组进行转录组测序、功能注释、差异基因分析和蛋白质互作分析等,对重金属Cu2+胁迫下草履虫的毒性效应和分子机制做了初步分析和探讨。主要结论如下:(1)在0.01 mg/L的Cu2+处理24 h下,草履虫转录组中约有283个基因上调,296个基因下调;在0.02 mg/L的Cu2+处理24 h下,草履虫转录组中约有246个基因上调,357个基因下调;在0.01 mg/L的Cu2+处理96 h下,草履虫转录组中约有413个基因上调,411个基因下调;在0.02 mg/L的Cu2+处理96 h下,草履虫转录组中约有17个基因上调,13个基因下调;(2)对草履虫的差异基因在GO数据库中进行注释,发现在24 h处理下,0.01 mg/L的Cu2+胁迫下草履虫在细胞膜组分、细胞质组分、金属离子结合、GTP结合等被富集到;在处理时间为24 h处理浓度为0.02 mg/L下,在GO数据库中注释到的功能与相同时间下浓度为0.01 mg/L时类似,但注释到的GO词条更多,差异倍数也更加明显,说明在高浓度重金属铜的作用下,草履虫体内更多生命过程和生物组分发生了响应。在KEGG数据库注释中,低浓度的铜胁迫下差异基因主要在核糖体、激酶激活、减数分裂等代谢过程被富集,另外在MAPK信号通路、cAMP信号通路、Rap1信号通路、AMPK信号通路等也有被注释到;高浓度的铜胁迫下主要在减数分裂、细胞衰老、MAPK信号通路、mRNA监测通路、AMPK信号通路、Gap间隙连接、细胞周期和内吞作用等。两个浓度均在MAPK信号通路和AMPK信号通路注释到说明重金属铜对草履虫能量代谢和细胞生长、分化、转录和信号转导均有影响,草履虫通过调节能量代谢和细胞转录等过程适应环境中的铜离子。(3)在处理时间为96 h时,0.01 mg/L的Cu2+胁迫下草履虫在金属离子结合、ATP结合、核糖体结合、锌离子结合、DNA结合、膜组分等被富集到;0.02 mg/L的Cu2+胁迫下草履虫在ATP结合、膜组分、跨膜转运、阳离子转移等方面被富集,但高浓度的铜离子注释到的条目更少,差异倍数也更低。可能是因为高浓度作用下草履虫在传代过程中发生了更多适应性变化。在KEGG数据库注释中,主要在延长因子、大亚基核糖体蛋白、组蛋白脱乙酰酶、ATP依赖的RNA解旋酶、微管蛋白、碳代谢、三羧酸循环等代谢通路被注释到,可以看到,随着时间的变化,草履虫的差异基因更多富集在与生命活动有关的代谢通路,可能与重金属的固定、吸收以及草履虫的抗铜适应性有关。(4)对测序结果进行蛋白质互作分析,得到了 XP-001439374.1、XP-001441029.1、XP-001440423.1在内的多个蛋白可能在草履虫抗铜机制中发挥重要作用,需要进一步实验验证。