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目的:癫痫是多种病因导致的慢性脑部病变,以大脑神经元过度、反复超同步化放电为特征,临床表现为短暂性中枢神经系统功能失常的综合征。氧化应激损伤、谷氨酸兴奋性毒性、钙超载等多种因素都能诱导神经元异常放电触发癫痫。其中氧化应激产生的氧自由基连锁反应是神经元受损的核心病理环节。已有研究表明,癫痫发作时脑内自由基含量明显增加,ROS大量产生和释放,会引起细胞内氧化还原平衡状态被打破,导致一系列诸如DNA损伤、细胞膜结构被破坏、线粒体等细胞器被破坏等现象,最终导致细胞凋亡。因此,抑制氧化应激和清除氧自由基可能是癫痫治疗的重要策略。Keap1-Nrf2-ARE信号通路在细胞抗氧化过程中起着重要作用。Keap1为E3泛素连接酶CUL3提供支架,而后者能够通过泛素-蛋白酶体介导Nrf2降解,使Nrf2仅维持较低水平,以保证日常生命活动。氧化应激时,上游相关信号通路被激活,介导Nrf2降解终止并入核,促进下游HO-1等抗氧化相关基因的转录,参与细胞抗氧化防御机制。柚皮素为黄酮类化合物,具有较强的抗氧化活性。本研究以癫痫持续状态大鼠模型和人神经母细胞瘤细胞氧化损伤模型为研究对象,通过体内和体外实验,探讨柚皮素对癫痫大鼠脑损伤的神经保护作用以及通过Nrf2/HO-1通路抑制神经细胞氧化损伤的可能作用机制,为癫痫的抗氧化治疗提供研究基础。研究方法:1.建立氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫持续状态（status epilepticus,SE）模型,实验分为对照组、SE组和柚皮素组。应用脑电记录仪检测大鼠脑电图改变;水迷宫实验观察大鼠空间学习记忆能力;HE染色观察大鼠海马组织病理改变;尼氏染色观察存活神经元变化;TUNEL染色检测程序化死亡细胞;Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Nrf2和HO-1蛋白表达水平。2.体外培养人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,MTT检测各组细胞增殖活性;DCFH-DA荧光染色检测活性氧（ROS）水平;JC-1荧光染色和罗丹明123染色检测线粒体膜电位;流式细胞分析检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyto C蛋白表达变化。3.Western blot检测Nrf2和HO-1蛋白表达水平;免疫荧光观察Nrf2核内移情况以及HO-1蛋白定位;免疫共沉淀检测Nrf2与Keap1蛋白相互作用;转染Nrf2shRNA质粒,Western blot验证质粒转染效果;Western blot检测Nrf2基因沉默后各组细胞Nrf2、HO-1蛋白表达水平;Western blot检测pERK、ERK、pAKT、AKT蛋白表达水平;流式细胞分析检测细胞凋亡率;MTT检测细胞增殖活性。结果:1.脑电记录仪结果显示,对照组大鼠脑电图节律规整,未见异常波形;癫痫组大鼠脑电图可见广泛性棘波节律发放。2.水迷宫实验结果显示,与对照组比较,癫痫模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长;柚皮素干预组逃避潜伏期明显缩短;与对照组相比,癫痫模型组大鼠穿越平台次数明显减少,柚皮素干预组大鼠穿越平台次数显著增加。3.HE染色结果显示,对照组大鼠海马组织结构和形态基本正常,细胞着色均匀,排列较规整,细胞核及核仁的大小正常,胞浆及胞核清亮,呈现浅红色及淡蓝色。癫痫后12h组,神经元细胞发生肿胀,胞浆透明,胞核及胞浆着色不均匀,细胞结构与形态紊乱;癫痫后ld组,可见锥体细胞明显丢失,神经元体积缩小,细胞核呈现固缩深染,核仁变小甚至消失,胞核及胞浆染色呈深蓝色和紫蓝色,且着色不均匀,大小不一,形态紊乱;癫痫后3d、7d和14d组,细胞形态与结构较癫痫后ld时逐渐恢复,神经元胞核及胞浆着色较前均匀,形态基本规整。4.尼氏染色结果显示,对照组大鼠海马区椎体神经元排列规则紧密,形态完整,核仁清晰,胞浆内尼氏体丰富,没有明显神经元丢失;与对照组相比,癫痫后ld组,大鼠海马神经元丢失明显,排列紊乱,可见细胞皱缩,染色质凝集成块、胞核固缩,胞浆内尼氏体明显减少;癫痫后3d、7d和14d组可见锥体细胞数目逐步回升,细胞间隙缩小,排列较规整,胞浆内尼氏体分布较丰富,核仁深染、固缩、碎裂等现象逐渐好转。5.Western blot结果显示,与对照组比较,癫痫后12h Nrf2表达水平升高,癫痫后1d达到高峰,3d、7d和14d逐渐下降。6.Western blot结果显示,与对照组比较,癫痫后12h HO-1表达水平升高,癫痫后1d达到高峰,3d、7d和14d逐渐下降。7.HE染色结果显示,与对照组相比,癫痫组细胞形态与结构明显紊乱,锥体细胞显著丢失,神经元体积缩小,细胞核固缩深染,核仁变小甚至消失。与癫痫组相比,柚皮素干预组细胞形态与结构较癫痫组明显恢复,锥体细胞丢失减少,胞核及胞浆着色较前均匀。8.尼氏染色观察柚皮素对癫痫大鼠海马组织病理损伤的影响。结果显示,与对照组相比,癫痫组大鼠海马神经元丢失明显,排列紊乱,可见细胞皱缩,染色质凝集成块,尼氏体数量显著减少。与癫痫组相比,柚皮素干预组海马神经元边缘较清晰,仅有少量染色质凝集,尼氏体数量显著增加。9.TUNEL染色结果显示,对照组海马神经元胞核呈蓝色,细胞排列规整,着色均匀,偶见凋亡神经元;与对照组相比,癫痫组大鼠海马神经元TUNEL阳性细胞数显著增多;与癫痫组相比,柚皮素干预组TUNEL阳性细胞数明显减少。10.Western Blot结果表明,柚皮素可上调癫痫大鼠海马Bcl-2/Bax比例,抑制Caspase-3的激活。11.Western blot实验结果显示,与对照组比较,癫痫组大鼠海马组织Nrf2表达升高;与癫痫组比较,柚皮素干预组Nrf2表达显著升高。12.Western blot实验结果显示,与对照组比较,癫痫组大鼠海马组织HO-1表达升高;与癫痫组比较,柚皮素干预组HO-1蛋白表达显著升高。13.MTT检测结果显示,柚皮素呈剂量依赖性抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞增殖活性的降低。14.H2DCF-DA荧光染色检测细胞内ROS,结果表明H2O2组ROS显著增多;柚皮素干预可显著抑制H2O2诱导引起的ROS释放增加。15.线粒体膜电位检测结果显示,H2O2组线粒体膜电位显著降低;柚皮素干预可抑制H2O2诱导引起的线粒体膜电位下降。16.流式细胞分析发现,H2O2组凋亡率显著增多,柚皮素干预可抑制H2O2诱导的凋亡增加。17.Western Blot结果显示,氧化应激条件下,柚皮素可上调Bcl-2/Bax比例;抑制细胞色素C的释放;抑制Caspase-3的激活。18.Western Blot结果显示,柚皮素上调HO-1的表达,免疫荧光结果显示上调的HO-1主要分布于细胞浆内。19.柚皮素激活Nrf2,Western Blot结果显示,柚皮素上调Nrf2的表达;柚皮素促进Nrf2进入细胞核,免疫荧光结果亦显示柚皮素促进Nrf2的进入细胞核。20.免疫共沉淀实验结果显示,对照组Nrf2与Keap1存在蛋白相互结合,柚皮素干预后,Nrf2与Keap1结合明显减少。21.Western Blot结果显示,转染shRNANrf2后,SH-SY5Y细胞Nrf2和HO-1蛋白表达水平均降低。22.Western Blot结果显示,沉默Nrf2后抑制柚皮素对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞Nrf2和HO-1表达升高。23.流式细胞凋亡检测发现,Nrf2沉默部分逆转柚皮素对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用。24.柚皮素激活ERK1/2和PI3K/Akt。Western Blot免疫印迹结果显示,柚皮素时间依赖性激活ERK1/2和PI3K/Akt。25.ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K/Akt抑制剂LY294002抑制柚皮素引起的HO-1表达上调,提示ERK1/2和PI3K/Akt参与柚皮素诱导的HO-1的表达上调。26.HO-1活性抑制剂ZnPP预处理可逆转柚皮素对H2O2诱导的氧化损伤的抑制作用,说明柚皮素上调HO-1的表达参与抑制H2O2诱导的氧化损伤。结论:1.柚皮素改善癫痫大鼠的空间学习记忆能力。2.柚皮素通过抗凋亡途径抑制癫痫大鼠脑损伤。3.柚皮素促进癫痫大鼠海马神经元Nrf2和HO-1的表达。4.柚皮素可能通过线粒体相关抗凋亡途径抑制SH-SY5Y细胞氧化损伤。5.柚皮素通过促进Keap1与Nrf2解离上调Nrf2表达。6.柚皮素通过激活ERK1/2和Akt通路上调Nrf2依赖的HO-1表达。总之,柚皮素对匹罗卡品诱导的幼年癫痫大鼠脑损伤具有神经保护作用。柚皮素通过激活ERK1/2和Akt通路,进而上调Nrf2/HO-1通路,从而抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤。