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本论文采用基因工程技术构建含有hFL和hGM-CSF基因的真核表达质粒,对荷瘤小鼠进行裸DNA治疗,使hFL和hGM-CSF在小鼠体内表达,产生协同作用,更大程度地扩增DCs和NK细胞,增强和促进特异性及非特异性免疫能力,从而达到抑制肿瘤生长的目的.首先用PCR方法分别以PIC9K-hFL和HTB194为模板,扩增得到含有信号肽序列的hFL膜外区编码序列和hGM-CSF基因序列.并将两者分别插入PCDNA3.1/Zeo,使之处于CMV启动子的调控下,构建成真核细胞组成性表达载体,命名为hFL-PCDNA3.1/Zeo和hGM-PCDNA3.1/Zeo.另外,在hFL-PCDNA3.1/Zeo中,用hGM-CSF基因替代原有的Zeocin抗性基因序列,使之处于SV40启动子的调控下,构建成含有hFL和hGM-CSF双基因的表达载体.命名为hFL-hGM-PCDNA3.1.然后,将重组质粒DNA通过大肠杆菌扩增,用碱裂解法裂解菌体获得质粒DNA粗提液,经Sephacryl S1000层析柱分离、纯化,获得了高纯度重组质粒DNA,回收率为7-8mg/L发酵液.将三种重组表达质粒及PCDNA3.1/Zeo分别转染293细胞,收集表达上清,用Western Blot法、ELISA法来检测hFL和hGM-CSF基因在293细胞中的表达.结果显示:hFL和hGM-CSF在293细胞中均获表达,且hFL和hGM-CSF可能由于糖酰化而使其分子量大于原核表达产物;上清中hFL和hGM-CSF的浓度分别为50ng/ml和30ng/ml.并发现hGM-PCDNA3.1/Zeo和hFL-hGM-PCDNA3.1转染293细胞所得表达上清具有刺激依赖hGM-CSF的细胞系Tf1细胞增殖的作用,而hFL.PCDNA3.1/Zeo和PCDNA3.1/Zeo并无此能力.说明293细胞表达所得hGM-CSF具有完全生物学活性.将质粒DNA与阳离子脂质体在室温下孵育,形成稳定的复合物,以每只小鼠注射20pg的剂量,隔天注射C57BL/6小鼠后肢肌肉.共注射六次后,在小鼠皮下接种小鼠T淋巴瘤细胞EL-4 2×10<5>/只,发现在接种后的第10d,所有小鼠都在接种部位出现肿块,成瘤率达100%.隔日测量小鼠肿瘤的体积,观察肿瘤的生长及小鼠的生存状况.结果显示三个实验组都对肿瘤生长有一定抑制作用,联合应用hFL-PCDNA3.1/Zeo和hGM-PCDNA3.1/Zeo组较单用hFL-PCDNA3.1/Zeo或hGM-PCDNA3.1/Zeo组可以更为有效地抑制肿瘤生长,在17d抑瘤率约为40%,而后两者仅在早期有约20%的抑制肿瘤生长作用.4个组小鼠都有相同的生存期,肿瘤的减小并不能相应地延长小鼠的生存时间.