木聚糖酶催化木聚糖1,4-β-D-木糖苷键的水解,在饲料、食品、能源转化等众多领域具有重要应用,其中碱性木聚糖酶已被证明能够在造纸工业中改善纸浆性能,并减少环境污染,其发挥新酶资源的开发及耐碱机制的研究近年来受到广泛关注。在此背景下,本论文分别以来源于Cellulomonas bogoriensis和Bacillus sp.NG-27的两种GH10家族碱性木聚糖酶为研究对象,通过定点突变和序列删减等方法研究了催化残基附近氨基酸的性质及富含酸性氨基酸的短序列在GH10家族木聚糖酶耐碱性方面可能的作用。具体研究结果如下:1.催化残基附近氨基酸对酶耐碱性的影响利用定点突变技术对催化残基+1、+2和+3位氨基酸进行了研究。在催化残基+1位,基于疏水性变化将Xyn486的A突变为V和N,将BSX的V突变为A和N,基于电荷情况,将Xyn486和BSX的氨基酸均分别突变为D和H。突变体pH特性的检测结果显示增加氨基酸疏水性,木聚糖酶最适pH向碱性偏移,耐碱性增强;降低氨基酸疏水性,木聚糖酶最适pH向酸性偏移,耐碱性减弱;引入负电荷没有改变木聚糖酶的最适pH及pH稳定性,但降低了酶在酸性和碱性条件下的活性及碱性条件下的稳定性;引入正电荷也未能改变酶的最适pH,但降低酶在酸性和碱性条件下的活性及酸性条件下的稳定性。在催化残基+2位,基于疏水性变化将Xyn486的F突变为I、A和N,将BSX的V突变为A和N,基于电荷情况,将Xyn486和BSX的氨基酸分别突变为D、H、E和D、H。突变体pH特性的检测结果显示增加氨基酸疏水性,木聚糖酶最适pH向碱性偏移,耐碱性增强;降低氨基酸疏水性,木聚糖酶最适pH向酸性偏移,耐碱性减弱;引入负电荷没有改变木聚糖酶的最适pH及酸性和碱性条件下的酶活,但降低了酶在极碱性条件下的稳定性,缩小了酶活性的pH范围;引入正电荷未能改变酶的最适pH,酶活性的pH范围及酸性和碱性条件下的活性,但会使酶的稳定性产生一定变化。在催化残基+3位,基于疏水性变化将Xyn486的E和BSX的D均突变为I,基于电荷情况,将Xyn486的氨基酸突变为Q、N、E、H和K,将BSX的氨基酸突变为N和H。突变体pH特性的检测结果显示增加氨基酸的疏水性,会对酶的最适pH、酶活性的pH范围、不同条件下酶的活性及酶的pH稳定性产生影响,其中对于降低酶在极碱条件下的稳定性是确定的,而在其他方面的变化并无规律性;消除氨基酸所带的负电荷,会降低酶的耐碱性;引入正电荷,会增加酶的最适pH,降低酶在极碱条件下的稳定性。2.富含酸性氨基酸的短序列在酶耐碱性的影响通过序列比对确定了可能与木聚糖酶耐碱性相关的的三段富含酸性氨基酸的短序列,利用融合PCR技术构建了木聚糖酶BSX的截短突变体BSX-over-1、BSX-over-2和BSX-over-3,Xyn486的截短突变体Xyn486-over-2,Xyn486的插入突变体Xyn486-insertion-1和Xyn486-insertion-3,对其性质进行测定。结果显示,与野生型相比BSX-over-1、BSX-over-3的最适pH未发生变化,但酶活性及pH稳定性降低,特别是在碱性条件下的稳定性降低的最为明显;BSX-over-2完全失活无法进行性质检测。插入突变体Xyn486-insertion-1的最适pH与野生型一致,但碱性条件下活性和pH<11范围内的稳定性有所增加;Xyn486-insertion-3的最适pH向酸性偏移,碱性下酶活性降低,pH稳定性下降;Xyn486-over-2与BSX-over-2一样,酶活性完全丧失。实验结果说明富含酸性氨基酸的短序列可能会在一定程度上提高酶的耐碱性,但在不同的酶中作用不同,同时这些短序列对于酶结构和功能的稳定具有一定影响。本研究的结果为木聚糖酶耐碱机制的阐明提供了实验信息,为利用蛋白质工程改造开发碱性木聚糖酶资源奠定了基础。