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生物乙醇吸引越来越多的关注和应用,主要原因是它作为可再生液体交通燃料,既可缓解石油能源危机,也可减少温室气体排放。生物乙醇即可以单独或与汽油混配制成乙醇汽油作为汽车燃料。生物乙醇燃料燃烧所排放的二氧化碳(CO2)约等于生产乙醇所用生物质吸收的CO2, CO2净排放等于零。生物乙醇可用不同类型的可再生原料采用微生物发酵法来生产,第1代原料-甘蔗、玉米、小麦、木薯和甜高粱等,第2代原料-木质纤维素生物质,第3代原料-藻类生物质。针对木薯乙醇和纤维素乙醇中存在的问题,我们从三个角度进行研究和改进工艺或菌种:1)通过采用和优化降粘酶来完成木薯浓醪发酵;2)基于CO2固定构建可高效代谢木糖的工程酿酒酵母;3)构建可直接发酵纤维素和木糖的工程酿酒酵母。发酵终点乙醇浓度越高,生产燃料乙醇精馏和脱水工段将节省更多能量。初始醪液浓度决定了发酵终点乙醇浓度,而木薯的高粘度特性限制了初始木薯醪液的浓度。最简单的方法是玉米和木薯联合发酵,当玉米占比达40%以上时,乙醇浓度可达到109.3 g·L-1,乙醇得率达到87 %以上,分别比单独木薯发酵时高9.4%和11%。为了完成木薯浓醪发酵,我们在拌料阶段和发酵阶段采用降粘酶进行降粘,优化的拌料阶段降粘酶配方为:液化酶12U·g-1,纤维素酶10 U·g-1,木聚糖酶5U·g-1,酸性果胶酶8 U·g-1;优化的同步糖化发酵阶段降粘酶配方:糖化酶150 U·g-1,普鲁兰酶0.08 U·g-1,酸性蛋白酶10 U·g-1,纤维素酶10 U·g-1,木聚糖酶5U·g-1。采用同步糖化发酵方式,当发酵38%(w-v-1)木薯醪液时,原料淀粉利用率达到94.47%,终点乙醇浓度达到140 g·L-1,平均乙醇生产速率达到2.86 g·L-1·h-1。降粘酶的添加增加了酶投入成本,而原料出酒率的提高减少木薯原料的使用,使得总投入成本降低。木质纤维素水解液中的第二大糖类-木糖由于不能有效地酿酒酵母转化为乙醇而阻碍了纤维素乙醇的商业化应用。首先,我们通过在SaccharomycescerevisiaeYS58联合表达外源的木糖还原酶(xylose reductase, XR)基因 XYL1,突变木糖还原酶[XR (R276H)]基因 mXYL,木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase, XDH)基因XYL2和内源的木酮糖激酶(xylulokinase,XK)基因XKS1获得了工程酵母YSX4,实现了酿酒酵母对木糖的利用。YSX4发酵木糖和葡萄糖时木糖消耗速率为0.57g·L-1·h-1,而发酵木糖和麦芽糖时木糖消耗速率为0.7g·L-1·h-1,糖的同步消耗有助于木糖代谢。进一步,我们在YSX4上联合表达核酮糖-1,5-2P羧 化酶[Form-Ⅱ ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase(Rubisco)]基因cbbM,磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase, PRK))基因sPR 和分子伴侣(chaperone)基因GroEL-GroES构建了形式-Ⅱ的CO2固定系统,获得工程酵母YSX4C111;或联合表达来自Ralstonia eutropia H16 Form-Ⅰ Rubisco基因c bL1-cbbS1,PRK 基因cfxP1和S. cerevisiae内源 chaperone 基因HSP60-HSPl0构建了形式-Ⅰ CO2固定系统,获得工程酵母YSX4C222。当发酵麦芽糖和木糖时,YSX4C111和YSX4C222的木糖消耗速率分别达到0.97 g·L-1·h-1和1.1 g·L-1·h-1 YS X4C222总糖消耗速率和总乙醇得率为3.1 g·L-1·h-1和0.47 g·g-1,分别比对照菌YSX4C000高63%和15%。测得YSX4C222的Rubisco胞外羧化酶活性也最高。我们评估不同时间段的相对C02通量,约8%来自木糖的核酮糖通过CO2途径被转化为乙醇。通过计算工程酵母的CO2固定速率,YSX4C111和YSX4C222的平均C02固定速率分别达到336.6和436.3 mg·L-1·h-1,远高于自然的或工程化的可固定CO2微生物的C02 固定速率(5.8-147.0 mg·L-1·h-1)。可发酵糖和纤维素整合工艺(Consolidated bioprocessing,CBP)对于利用菌株以纤维素为底物发酵产乙醇是最有前景的选择。我们通过代谢工程和基因工程手段实现工程Scerevisiae 在有限接种条件下联合发酵纤维素和蔗糖或木糖。基于之前构建的半乳糖和纤维素联合发酵菌株,我们首先用组成型启动子替换了纤维小体表达和组装的诱导型启动子。构建的工程菌EBY101-CC在联合发酵羧甲基纤维素(Carboxy Methylated Cellulose, CMC)和蔗糖时,以蔗糖分批补料方式进行发酵,10 g·L-1 CMC能完全被消耗且生产4.3 g·L-1乙醇,总乙醇得率为0.43 g·g-1。在此菌株基础上进一步构建木糖代谢途径和强化纤维素降解功能,获得的工程菌EBY101-X5CC和EBY101-X5CP分别发酵木糖和CMC或磷酸膨胀纤维素(phosphoric acid-swollen cellulose,PASC),当木糖耗尽时,10g·L-CMC可产生2.9g·L-1乙醇,l0g·L-1 PASC可产生1.2g·L-1乙醇。