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目的:本实验应用脂多糖体外刺激SD大鼠脾脏组织调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)模拟脓毒症时Treg细胞免疫状态,予以血必净干预后,通过检测Treg细胞特异性标志物及功能、代谢相关细胞因子水平变化情况,以及共培养条件下对效应性T细胞(Effective T cell,Teff)增殖分化和辅助性T细胞(T helper cell,Th)分化漂移的影响,以明确血必净对Treg细胞免疫功能和代谢方面的调节作用;同时在血必净应用基础上,加用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂,通过检测对Treg细胞代谢和AMPK信号通路相关蛋白表达情况的影响,以阐明AMPK在血必净调节脓毒症Treg细胞免疫功能中的作用。方法:1.磁激活细胞分选法(MACS)分选出正常SD大鼠脾脏组织CD4~+CD25~+Treg及CD4~+CD25~-Teff细胞,流式细胞术检测细胞纯度;将体外分离的Treg细胞分为对照组、抗CD3/CD28组、抗CD3/CD28+LPS组、抗CD3/CD28+LPS+血必净组,培养72h;2.流式细胞术(FCM)检测CTLA-4/Foxp3表达,使用ELISA法检测Treg细胞上清中IL-10、TGF-β浓度;3.Treg与Teff按照细胞数1:1共培养68h后,CFSE染色法测Teff细胞的增殖,使用ELISA法测定共培养上清中IL-2、IL-4、IFN-γ浓度;4.FCM检测Treg的CPT-1和GLUT1强度和细胞内活性氧(ROS)水平;5.将提取到的Treg细胞分为对照组、抗CD3/CD28组、抗CD3/CD28+LPS组、抗CD3/CD28+LPS+A-769662组、抗CD3/CD28+LPS+血必净组、抗CD3/CD28+LPS+血必净+A-769662组,重复上述实验。用WB方法检测各组p-AMPKα和AMPKα表达。结果:1.抗CD3/CD28+LPS组CTLA-4、Foxp3表达量、IL-10/TGF-β浓度最高,对Teff增殖的抑制能力最强,并且抗CD3/CD28+LPS组IFN-γ/IL-4浓度比值最低;抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组Treg细胞CTLA-4、Foxp3表达量以及上清中IL-10和TGF-β含量明显降低(P<0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必净组CD4~+CD25~-Teff细胞Divided%显著高于抗CD3/CD28+LPS组(P<0.05),共培养上清中IFN-γ/IL-4浓度比值也明显升高(P<0.05);2.FCM结果显示:抗CD3/CD28+LPS组CPT-1和GLUT1表达显著高于其余各组(P<0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组接近于抗CD3/CD28组(P<0.05)。抗CD3/CD28+LPS组Treg细胞内ROS含量为1014.333±49.136,显著高于其余各组(P<0.05);抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组Treg细胞内ROS含量接近正常;3.与抗CD3/CD28组相比,抗CD3/CD28+LPS组p-AMPKα表达显著增加(P<0.05),抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组AMPKα磷酸化显著降低(P<0.05);与抗CD3/CD28+LPS+血必净(20μl/ml)组相比,抗CD3/CD28+LPS+血必净+A-769662组AMPKα磷酸化水平明显升高(P<0.05)。结论:1.血必净能有效缓解体外细胞模拟脓毒症调节性T细胞免疫抑制状态;2.在体外模拟脓毒症状态下,Treg细胞主要的代谢方式是FAO和糖酵解,使用血必净能有效抑制两种代谢方式,并且通过减少细胞内ROS的水平,避免脓毒症时线粒体的损伤;3.血必净通过限制AMPKα磷酸化影响LPS刺激调节性T细胞免疫代谢。