论文部分内容阅读
背景骨骼是一个不断生长、修复损伤、调节体内钙和磷酸盐代谢的动态器官。骨感染是骨科领域的严重并发症。破骨细胞是骨骼系统中唯一具有骨吸收能力的细胞。骨感染如细菌性关节炎、骨髓炎和内植物相关感染可导致破骨细胞过度激活,导致病理性骨质破坏,引起骨折延迟不愈合和不愈合。化脓性链球菌(GAS)是引起骨感染的最重要的细菌之一,可引起化脓性关节炎和骨髓炎等相关骨感染,并导致关节和骨的炎性破坏。近年来化脓性链球菌引起骨感染不断增加,了解GAS与骨相互作用对于治疗抗生素耐药性和持续感染的新型治疗策略的发展至关重要。链球菌溶血素O(SLO)是化脓性链球菌分泌的一种标志性毒素,大多数临床GAS分离株可以检测到该毒素,并且其在侵袭性感染中过度表达。然而,SLO在GAS诱发的骨质破坏中的确切作用很大程度上仍然未知。目的因此本次课题以Raw 264.7细胞作为破骨细胞前体,采用RANKL+M-CSF作为诱导因子,建立体外诱导破骨细胞分化模型,探索化脓性链球菌溶血素O是否影响OC的分化、细胞融合以及骨吸收能力;并进一步在mRAN及蛋白水平探索OC分化标志基因的表达及其有关蛋白通路的改变。方法以RANKL+M-CSF为诱导剂,促进小鼠单核巨噬细胞系Raw264.7细胞分化建立体外破骨细胞分化模型,根据CCK8检测结果,给予溶血素O(0.25、0.5、1、2.5μg/ml)分别处理Raw264.7细胞后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色并计数形成的TRAP阳性细胞数量,FAK染色检测破骨细胞的融合能力,使用胶原板检测破骨细胞的骨吸收活性,RT-PCR技术检测破骨细胞特异性基因TRAP,MMP9,Integrinβ3,CTR,ATP6v60d,DC-STAMP的表达,流式技术检测破骨细胞凋亡率,Western-blot检测转录因子(c-fos,NFATc1)、NF-κB通路(IκBα,p-IκBα,p65,p-p65)、凋亡通路(Bax,Bcl-2,Caspase-3)等蛋白的表达量。结果1、溶血素O抑制RANKL诱导Raw264.7向成熟破骨细胞的分化及融合对不同浓度SLO处理的Raw264.7行TRAP染色及FAK染色。在显微镜下进行观察:与空白对照组相比,阴性对照组(RANKL组)中有多核破骨细胞形成,且细胞体积明显增大。加入溶血O处理后,实验组中多核破骨细胞数量较阴性对照明显减少,同时破骨细胞体积明显减少。且溶血素O(2.5μg/ml组)阳性细胞数最少,其对破骨细胞分化的抑制作用呈浓度依赖性。CCK8检测结果:0.25-2.5μg/ml浓度的SLO对Raw264.7的增殖无明显差异。由此表明,RANKL在体外能够有效诱导多核破骨细胞的形成,并促进破骨细胞的融合,溶血素O能够抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。2、溶血素O抑制破骨细胞的骨吸收功能在空白对照组相比,加入RANKL处理后,阴性对照组中出现明显的骨吸收区域;加入溶血素O(0.25、0.5、1、2.5μg/ml)处理后,实验组中的骨吸收区域较阴性对照组明显减少,且随着溶血素O浓度的增大,骨吸收区域呈下降趋势。由此表明:RANKL在体外诱导破骨细胞骨吸收,SLO能够抑制破骨细胞的骨吸收能力。3、溶血素O下调OCs分化标志基因的表达以PCR检测OCs分化相关的标志基因,如TRAP,MMP9,Integrinβ3,CTR,ATP6v60d,DC-STAMP;与空白对照组相比,RANKL组中各基因的表达量显著升高;加入溶血素O处理后,实验组中破骨细胞形成相关基因的表达量较RANKL组明显降低。4、溶血素O诱导RANKL诱导的破骨细胞凋亡流式技术用来检测SLO对破骨细胞凋亡的作用,与RANKL组相比,溶血素O(1、2.5μg/ml)中凋亡的OCs显著增加。可见:SLO能够促进OCs凋亡。5、溶血素O抑制RANKL诱导的转录因子(c-fos,NFATc1),NF-κB通路(IκBα,p-IκBα,p65,p-p65)RANKL能够促使Raw264.7细胞分泌转录因子c-fos,NFATc1,SLO(1、2.5μg/ml)能够明显减少这两种转录因子的表达。在破骨细胞分化NF-κB通路,溶血素O能够明显抑制IκBα,p65的磷酸化。同时,SLO能够显著上调促凋亡蛋白Bax,cleaved caspased3的表达,下调抑凋亡蛋白Bcl2的表达。这些表明溶血素O能够抑制RANKL诱导c-fos,NFATc1的表达,通过NF-κB通路抑制破骨细胞分化,并促进破骨细胞凋亡。结论:SLO能够显著降低破骨细胞的分化、融合以及骨吸收的能力,该过程是由降低NF-κB通路蛋白的表达实现。同时溶血素O可以促进破骨细胞凋亡,这一作用可能是通过Bax/Bcl2-cleaved caspase 3实现的。小结:在本实验研究中,从以下几个方面证实了化脓性链球菌溶血素O能够抑制RANKL诱导的Raw264.7细胞向成熟OCs分化,并促进OCs的凋亡:(1)溶血素O抑制RANKL诱导的Raw264.7细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶的表达,并减少其形成TRAP阳性破骨细胞数量;(2)溶血素O能够抑制RANKL诱导的Raw264.7细胞的相互融合,下调核/细胞的比例;(3)溶血素O能够抑制RANKL诱导Raw264.7细胞形成OCs的骨吸收能力;(4)在mRAN水平,溶血素O能够抑制破骨细胞特异性基因抗酒石酸酸性磷酸酶、金属基质蛋白酶-9、β整合素3、降钙素受体、ATP酶H+运输V0亚基d2、树突状细胞特异性跨膜蛋白的表达;(5)在蛋白水平,溶血素O能够降低破骨细胞表达c-fos,NFATc1蛋白;(6)溶血素O能够下调NF-κB通路中IκBα,p65的磷酸化;(7)溶血素O能够促进破骨细胞凋亡并促进Bax/Bcl2,cleaved caspase 3的表达。综上所述,化脓性链球菌溶血素O能够抑制破骨细胞分化、融合以及对骨的吸收能力,这一作用可能是通过抑制NF-κB通路而实现。同时溶血素O能够通过Bax/Bcl2-cleaved caspase 3途径促进破骨细胞凋亡。