研究背景恶性肿瘤是全球人口死亡的一个重要原因,严重影响上亿人口的健康与生活。肿瘤发展是一个复杂的生物学过程,肿瘤的生长不断受到免疫系统的控制,免疫系统将癌细胞视为对机体内环境稳定的潜在威胁,导致先天性免疫和适应性免疫效应。肿瘤的生长不仅依赖于原发癌细胞中基因异常的积累,而且还依赖于能够为癌细胞的生存、生长和迁移提供一个优良条件的局部微环境。补体系统在机体内调节炎症,促进免疫防御机制,维持组织内稳态。现在认为补体是肿瘤相关性炎症的关键组分。肿瘤微环境中补体激活和调节之间微妙的平衡关系,导致肿瘤持续的激活补体并不断的产生补体介质,其中一些补体介质具有支持肿瘤生长和转移的功能。恶性肿瘤细胞可以利用补体激活产生一系列的癌症生长有利的反应,例如慢性炎症,免疫抑制,血管生成和癌细胞信号。与肿瘤存在潜在相关性的大量补体因子中,过敏毒素C3a和C5a现在被认为是建立肿瘤生长有利微环境的关键因素。C3a与G蛋白偶联受体C3aR结合发挥作用。一些研究已经确定了C3a-C3aR在肿瘤生长中的发挥重要作用,但迄今为止仍然没有选择性和有效性较好的激动剂或拮抗剂用于探测人体内C3a的病理学作用。课题通过计算机辅助药物设计（CADD）中的3D-QASR（三维定量构效关系）虚拟筛选、药效团模型构建并用构建的模型筛选活性化合物,研究C3aR受体拮抗剂的结构对THP-1细胞（人单核巨噬细胞白血病细胞）和RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）的细胞毒性以及Ca²⁺释放实验研究其拮抗活性,对设计出更加有效的C3aR受体拮抗剂有重大的意义。研究目的本课题使用文献中获得的C3a受体活性化合物,采用CADD中的3D-QASR的研究和基于化合物构效关系构建药效团模型研究,筛选化合物分子库,并用CCK8法和Ca²⁺释放实验检测其细胞毒性进细胞活性,找到有活性的C3a受体拮抗剂。研究内容1.C3aR受体拮抗剂的3D-QASR研究53个已知结构和活性的C3a受体活性化合物,随机选取17个化合物作为测试集来评价模型的预测能力,其余36个化合物为训练集,构建3D-QASR模型。2.基于化合物构效关系构建药效团及化合物的筛选把100个化合物筛选出训练集,基于化合物构效关系构建药效团模型,再用测试集化合物分子验证构建的药效团,用构建的最优药效团筛选经ADMET初筛后的活性化合物分子库,并用构建的药效团对筛选出的先导化合物的活性进行预测。3.CCK-8法检测化合物对THP-1细胞和RAW264.7细胞的细胞毒性先测试THP-1细胞和RAW264.7细胞的生长曲线,确定两株细胞的最适培养条件,即细胞培养个数和培养时间;台盼蓝拒染法快速简便的检测细胞存活率;再检测不同浓度的DMSO试剂对THP-1细胞和RAW264.7细胞的增殖影响,排除DMSO试剂对实验的影响;最后用CCK-8法检测化合物对细胞THP-1和RAW264.7的细胞毒性。4.Ca²⁺释放实验检测化合物活性为了确定197和233化合物是否具有对C3aR的拮抗作用,采用了基于c3a诱导的THP-1细胞和RAW264.7细胞的Ca ²⁺释放实验。研究结果1.成功构建CoMFA模型和CoMSIA模型。并从CoMFA和CoMSIA模型的三维等势图可知,C3aR受体拮抗剂活性结构需拥有一个稳定母核结构,并要有立体场、疏水性及静电场,这为后面药效团的构建及筛选C3aR受体拮抗剂活性化合物提供了有效的建议。2.构建了多个活性药效团并筛选出一个打分较高的3D QSAR药效团,包含四个药效团元素特征。用药效团筛选出完全匹配四个药效团元素特征的8个化合物,并预测出其活性,药效团活性预测结果与CoMFA和CoMSIA模型预测结果相一致。3.THP-1、RAW264.7细胞在24h时增值较快,THP-1细胞数在8×10³个为宜,RAW264.7细胞数在6×10³个为宜。DMSO试剂的终浓度保持在0.25%以内,对THP-1和RAW264.7细胞的影响忽略不计。CCK-8法检测结果说明筛选到的化合物对THP-1细胞和RAW264.7细胞的毒性随着浓度增大而逐渐增强,最高浓度对细胞增殖的抑制率不到20%,可以进行下一步的Ca²⁺释放实验。4.拮抗剂SB290157对对THP-1细胞和RAW264.7细胞的Ca2+释放有一定的拮抗作用,两个筛选出来的化合物197和233,其中化合物233有一定的C3aR拮抗剂作用,而化合物197对C3aR拮抗剂的拮抗作用可以不计。结论经虚拟筛选及药效团的构建和筛选,得到的先导化合物中,化合物233与拮抗剂SB290157的效果一样,可以抑制Ca²⁺在细胞内的释放,有拮抗剂作用,化合物197对Ca²⁺在细胞内的释放抑制效果不明显。因此,可以设计、改造出选择性和有效性较好的C3a受体激动剂或拮抗剂。