背景:膀胱肿瘤是中国最常见的泌尿系统肿瘤之一,其每年的发病率和死亡率分别在80.5/100000和32.9/100000。尽管目前膀胱肿瘤的治疗有了很大的提高,其死亡率仍位居所有恶性肿瘤的第13位。根据肿瘤的浸润深度,约3/4的膀胱肿瘤为非肌层浸润性膀胱肿瘤(nonmuscle-invasivebladdercancer,NMIBC),1/4 的膀胱肿瘤患者在发现时已经发展成肌层浸润性膀胱肿瘤(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)。膀胱肿瘤的易进展性和易转移性是目前膀胱肿瘤相关死亡的两大主要原因。目前膀胱肿瘤的临床诊断仍缺少特异性的分子标记物,膀胱肿瘤的发生发展分子机制仍没有明确的定论,因此探寻膀胱癌进展的分子机制和寻找潜在的治疗小分子靶点和药物是目前的研究重点。细胞分裂周期相关蛋白5(Cell division cycle associated 5,CDCA5)是后期促进复合物的底物之一,因此能够发挥调控肿瘤细胞的周期的作用。有很多研究报道了其在多种肿瘤中的表达显著上升。在膀胱肿瘤中,CDCA5的表达、功能以及作用机制目前仍缺少相关系统性的研究。目前局限性的肌层浸润性膀胱肿瘤的5年生存率约60%,而伴有远处转移的肌层浸润性膀胱肿瘤患者5年生存期仅为10%。目前膀胱肿瘤的预后预测主要依靠TNM分期系统,尽管如此,对肌层浸润性膀胱肿瘤的预后预测的准确性仍需要进一步的改善。因此,临床上就需要更加方便,准确性更高的预后模型来指导膀胱肿瘤患者的危险分层,以及寻找特异性的预后相关分子标志物来帮助临床医生的临床决策,来判断哪些肌层浸润性膀胱肿瘤患者适合采用保留膀胱的治疗,哪些患者更加适合做新辅助化疗,哪些患者适合尽快行根治性膀胱切除以及更加个性化的治疗方法的选择。第一部分 CDCA5在膀胱癌膀胱肿瘤组织和膀胱肿瘤细胞系中的表达水平探讨目的:通过对膀胱肿瘤的临床组织样本中的CDCA5进行qRT-PCR检测,利用Western Blot和qRT-PCR检测膀胱肿瘤细胞系中CDCA5的表达情况,探索CDCA5对膀胱肿瘤发生发展的作用机制。通过分析TCGA癌症数据库和Oncomine肿瘤数据库中的膀胱肿瘤数据探索CDCA5在膀胱肿瘤中的表达,与肿瘤分期的相关性以及与预后的相关性。方法:1)通过对20例膀胱肿瘤患者的术后样本及其配对的膀胱肿瘤癌旁组织样本进行qRT-PCR和免疫组化检测CDCA5的表达情况,统计分析CDCA5在膀胱癌和癌旁组织中的表达差异。通过对膀胱肿瘤细胞系(RT4,T24,UMUC3,TCCSUP和5637)和永生化尿路上皮(SVHUC)进行qRT-PCR和Western Blot检测CDCA5在肿瘤细胞系中的相对表达水平。2)利用Oncomine数据库和TCGA数据库分析CDCA5在膀胱肿瘤组织中的表达情况,以及其表达高低与膀胱肿瘤患者生存期的关系。结果:1)在膀胱肿瘤的20对临床样本中,qRT-PCR结果显示肿瘤标本的CDCA5 mRNA水平较癌旁组织表达明显升高;免疫组化分析结果显示CDCA5在膀胱肿瘤中明显高表达。qRT-PCR和Western Blot结果表明CDCA5在膀胱癌细胞系中表达明显高于永生化的尿路上皮细胞。2)Oncomine数据库和TCGA数据库显示CDCA5在膀胱肿瘤中的表达较正常组织中的表达明显升高,且T分期越高CDCA5的表达水平也越高,Kaplan-Meier分析结果表明CDCA5的表达水平与膀胱肿瘤患者总体生存时间具有相关性(P=0.0384),高表达患者的总体生存时间较低表达患者生存时间短。结论:(1)CDCA5在膀胱肿瘤组织中的表达显著升高,同时在膀胱肿瘤细胞系中的表达也显著高于正常细胞。(2)CDCA5高表达的患者的总体生存率高于低表达患者,同时高表达患者中高级别膀胱肿瘤的比例较低表达患者高,高表达患者发生远处转移的比例高于低表达患者。故我们可以初步认为CDCA5可以作为膀胱肿瘤患者术后预后的危险因素,可以作为膀胱肿瘤诊断的分子标志物。第二部分 CDCA5在膀胱癌中的功能及分子机制研究目的:分别采用敲低和过表达肿瘤细胞中的CDCA5表达量,观察膀胱肿瘤细胞系增殖凋亡及细胞周期的改变。进一步研究CDCA5在肿瘤发展中调控的分子信号通路,寻找潜在的治疗靶点。方法:1)通过转染外源性干扰和过表达的慢病毒,分别构建敲低CDCA5的稳定转染细胞株(T24和5637)或过表达稳定转染细胞株(UMUC3)。通过体外实验,如Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验,克隆形成实验,周期凋亡流式实验,来初步研究CDCA5在膀胱肿瘤细胞系中增殖、细胞周期及凋亡的相关作用。2)通过Western Blot探索CDCA5影响膀胱肿瘤细胞周期的可能机制,寻找CDCA的表达和相关周期蛋白的关联。3)通过Western Blot探索CDCA5影响膀胱肿瘤细胞增殖的可能机制,寻找潜在的小分子治疗靶点。4)通过在裸鼠体内的肿瘤细胞皮下成瘤实验,研究CDCA5在体内成瘤过程中的作用和影响。5)通过TCGA膀胱肿瘤数据库中甲基化测序的数据,分析CDCA5启动子区域的甲基化水平改变。结果:1)CCK8和克隆形成实验表明敲低CDCA5的表达水平后,膀胱肿瘤细胞的活性、增殖能力显著降低,而过表达CDCA5后,膀胱肿瘤细胞的活性、增殖能力升高。2)细胞功能学实验结果表明,低表达CDCA5能够通过影响细胞G2/M期进展和促进细胞凋亡来抑制膀胱肿瘤细胞的增殖能力;反之,高表达CDCA5能够促进细胞G2/M期进展和抑制细胞凋亡来促进膀胱肿瘤细胞的生长。3)Western Blot实验结果表明,CDCA5通过上调两个关键的细胞分裂周期相关蛋白——细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2,CDC2)和周期蛋白B1(cyclin B1),同时激活Akt信号通路来调控肿瘤细胞的增殖。进一步研究发现CDCA5调控的细胞凋亡主要是通过线粒体凋亡通路的调控来影响肿瘤细胞的增殖。4)采用Akt的小分子激动剂SC-79实验表明,Akt的激活后可以挽救敲低CDCA5后导致的细胞增殖减慢。5)裸鼠的皮下成瘤实验结果表明,CDCA5低表达组的瘤体在重量和体积上均明显低于对照组,免疫组化分析表明低表达组的Ki67,Cyclin B1和p-Akt表达水平较对照组显著降低,而cleaved-Caspase3的表达水平较对照组升高。6)通过TCGA数据库分析CDCA5启动子区域的CpG位点的甲基化水平发现,肿瘤组织中CDCA5启动子区域的甲基化水平较癌旁正常组织显著降低,提示CDCA5在膀胱肿瘤组织中的异常表达可能和其启动子区域的异常甲基化相关。结论:1)CDCA5增强膀胱肿瘤细胞的活性和增殖能力,同时抑制肿瘤细胞的凋亡,体内实验表明其可以促进裸鼠皮下瘤体的生长和增殖。2)在分子水平上,CDCA5通过调节细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2,CDC2)和周期蛋白B1(cyclin Bl)等周期相关蛋白促进G2/M期进展,并通过调控线粒体凋亡通路相关蛋白(Caspase3,Caspase9,Bax,Bcl2,Bcl-XL等)调控肿瘤细胞的凋亡。3)CDCA5在膀胱肿瘤中通过激活Akt通路,从而促进膀胱肿瘤细胞的增殖和生长。4)裸鼠皮下成瘤实验表明当敲低CDCA5的表达水平后,瘤体的形成受到抑制。5)CDCA5在膀胱肿瘤中的异常表达可能和其启动子区域的甲基化水平改变相关。第三部分 一个基于DNA甲基化的肌层浸润性膀胱肿瘤的预后模型目的:通过对TCGA数据库中的甲基化测序结果(Methylation 450K),寻找肿瘤组织中和癌旁正常组织中差异甲基化探针,结合统计学分析R语言包和肿瘤患者的预后资料进一步建立能够预测膀胱肿瘤预后的DNA甲基化探针预后模型。方法:通过分析TCGA数据库中的资料,我们建立了一个基于DNA甲基化探针的肌层浸润性膀胱肿瘤总体生存时间(OS)的预测模型。首先,我们筛选出在膀胱肿瘤组织和癌旁正常组织中具有表达差异的甲基化探针,通过COX分析我们进一步筛选出与预后相关的差异性探针,随后我们通过LASSO(Absolute shrinkageand selection operation)建立预后预测模型。这个模型通过计算每个病人的危险评分(Risk score,RS)来评价每个膀胱肿瘤患者是低风险患者或是高风险患者。进一步该模型在验证组中进行了进一步的验证。最终,我们通过对临床上常用的预后评价因子以及RS分别做ROC曲线来比较我们的模型的预测价值。随后,将RS预后模型联合CDCA5的表达水平做亚组的OS生存曲线,观察亚组间的预后差异。结果:通过对TCGA膀胱肿瘤数据库中413例肌层浸润性膀胱肿瘤DNA甲基化测序数据的分析,我们建立了一个基于DNA甲基化探针的预后风险评估模型。该模型由7个甲基化特异性探针构成,它能够把膀胱肿瘤患者进一步分成高风险组和低风险组,高危组和低危组之间的总体生存时间存在显著性差异(训练组(Training):HR=2.660,95%CI=1.718-4.118,P=0.000011;测试组(Testing):HR=1.966,95%CI=1.099-3.514,P=0.02)。同时 ROC 曲线的 AUC 值在训练(Training)组(n=276)和测试(Testing)组(n=137)分别为(Training:3 年 AUC=0.73,5年 AUC=0.75;Testing:3 年 AUC=0.65,5 年 AUC=0.65),这一结果较临床上常用的TNM预测模型(T分期,N分期,Stage等)对膀胱肿瘤患者预后的预测准确性更高。此外,应用该模型能够进一步地将T2、T3-T4膀胱肿瘤患者,NO、N1-N3膀胱肿瘤患者,以及stage Ⅰ-Ⅱ、stageⅢ-Ⅳ膀胱肿瘤患者分成高危组和低危组,且高危组和低危组的OS具有显著性的差异(P值均小于0.05)。结合RS评分能进一步将CDCA5低表达组和高表达组分成低危组和高危组,两组间的OS具有显著性的差异(P值均小于0.05)。结论:基于DNA甲基化的风险评估模型能够提高临床上对膀胱肿瘤患者预后的预测准确性,能够指导临床医生对肌层浸润性膀胱肿瘤患者的治疗方案的选择。