研究背景：脑卒中因其发病率高、致残率高、死亡率高，严重危害人类健康和生命安全，然而目前临床上仍缺乏合适的神经保护剂减轻卒中脑损伤，因此寻找和发现缺血性卒中新的治疗靶点是当下脑血管病研究的热点。卒中后炎症反应是造成缺血性脑损伤的重要原因之一，在急性脑梗死时炎症反应首先表现为星形胶质细胞和小胶质细胞的大量激活，促进IL-1β，TNF-α等前炎症因子和MIP-1α，MCP-1等趋化因子水平增高，诱导外周淋巴细胞和中性粒细胞向中枢浸润，引起炎症级联放大效应而加剧脑损伤程度。另外卒中后免疫炎症反应与患者病情严重程度和预后亦直接相关，因此针对炎症反应作用机制的关键环节加以干预，有可能成为治疗脑梗死新的有效途径。FasL是死亡受体Fas的配体，FasL与Fas结合后能诱导表达Fas的细胞凋亡。既往认为FasL是维持免疫豁免状态的重要分子，某些肿瘤细胞可通过高表达FasL逃避免疫攻击，因此有研究试图通过大量表达FasL来诱导异体移植术中的器官免疫耐受。但结果恰恰相反，过表达FasL不但没能抑制移植术后的免疫排斥反应，反而引起更严重的炎症反应和更快的的排斥反应。近年来研究逐渐发现除了传统的细胞凋亡，FasL还可直接诱导免疫炎症反应，如促进前炎症因子和趋化因子IL-6，MCP-1和IL-8的分泌；诱导中性粒细胞和/或T淋巴细胞聚集等；同时FasL本身还是T细胞激活增殖的一种协同/共刺激分子。业已发现FasL参与肺、心脏等多种器官的炎症反应，而FasL基因突变能显著改善上述器官的炎症状态，起到器官保护作用。因此FasL也被认为是免疫炎症反应的重要中介。FasL亦参与中枢神经系统（central nervous system，CNS）免疫调节作用，在脑外伤、应激、缺血缺氧等情况下均发现患者病侧脑组织内FasL表达增高。然而，就FasL与缺血性卒中后免疫炎症反应的研究，无论是动物还是临床方面，都知之甚少，因为既往大多数FasL与脑缺血的研究均集中在FasL诱导细胞凋亡方面。既然免疫炎症反应是脑卒中发生发展的重要病因之一，而FasL又是诱导免疫炎症反应的重要分子，那么我们提出以下三个问题：1）FasL能否诱导卒中后免疫炎症反应加剧缺血性脑损伤？2）FasL诱导的免疫炎症反应是直接作用还是与其凋亡作用相关？3）FasL诱导卒中后炎症反应的病理机制以及哪些细胞内信号途径参与其中？该研究内容目前国内外少有相关报道，值得深入研究。第一部分FasL诱导卒中后炎症反应加重缺血性脑损伤目的：研究FasL在小鼠缺血性脑损伤中诱导免疫炎症的作用。方法与材料：选取3月龄的FasL基因突变（FasL—/—，gld）和野生型（C57BL/6J，B6）雄性小鼠（体重约22-24克），应用线栓法建立一侧大脑中动脉梗死模型（MCAO），缺血为时间2h，再灌注时间点选取6h、24h、72h。在上述3个时间点进行神经功能缺陷评分（NSS），TTC染色观察脑梗死体积、干湿重法评估脑水肿程度。荧光定量PCR检测缺血侧皮层脑组织前炎症因子IL-1β，TNF-α，IFN-γ；趋化因子MCP-1，MIP-1α，MIP-2以及抗炎因子IL-4，IL-10的mRNA表达水平，ELISA法检测缺血皮层脑组织和外周血血清中前炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白表达量，免疫组织化学法观察星形胶质细胞（GFAP+）、小胶质细胞（Iba1+）、中性粒细胞（MPO+）、淋巴细胞（CD3+）在B6和gld鼠缺血侧脑组织的表达量及其形态学改变。流式细胞术检测两组小鼠T淋巴细胞亚群CD4+，CD8+，Th1/Th2在缺血侧皮层脑组织和外周血中的变化。结果：两种小鼠在缺血再灌注6h到72h时间窗均出现神经功能障碍及脑梗死。B6小鼠在缺血后上述时间窗神经功能评分低，脑梗死体积及脑水肿面积大，而FasL突变的gld小鼠能显著改善其神经功能障碍症状，脑水肿和脑梗死体积较B6小鼠均减小。在缺血再灌注24h时间点，两组小鼠的炎症因子mRNA表达均增高，但FasL突变的gld小鼠前炎症因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和趋化因子MCP-1、MIP-1α、MIP-2mRNA表达水平较B6小鼠降低。相应的，gld小鼠抗炎因子IL-10的mRNA水平较B6小鼠增高，而抗炎因子IL-4的mRNA水平在两组小鼠缺血皮层脑组织未见明显差异。在缺血24h时间点，gld小鼠CNS内激活的GFAP+星形胶质细胞，Iba1+小胶质细胞及外周浸润的MPO+中性粒细胞较B6小鼠均减少。虽然CD3+T淋巴细胞的总数在两组小鼠中并无显著差异，但T淋巴细胞亚群的比例发生变化。在缺血24h时间点两组小鼠均检测到向脑组织中浸润CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞，但FasL突变的gld小鼠在缺血侧脑组织和外周血中的CD8+T淋巴细胞浸润减少，并且CD4+T细胞Th1/Th2比例降低并向Th2偏移。结论：FasL诱导卒中后免疫炎症反应，FasL突变可通过抑制炎症反应保护缺血性脑损伤。1）FasL突变降低炎症因子和趋化因子的mRNA与蛋白表达水平；2）FasL突变抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活及外周中性粒细胞的浸润；3）FasL突变下调CD8+T细胞以及CD4+T细胞亚群Th1/Th2的比例。第二部分FasL诱导的炎症作用不依赖其前凋亡作用目的：证明FasL能直接诱导卒中后炎症反应，而非细胞凋亡的继发作用。方法与材料：我们在MCAO术前24h给B6小鼠腹腔注射脂多糖（LPS i.p,0.5mg/kg），模拟和gld小鼠类似的缺血脑保护作用。比较MCAO术后24h三组小鼠（B6，gld，LPS预处理+B6组）的脑梗死体积及中性粒细胞浸润情况。AnnexinV染色检测细胞凋亡，双重免疫荧光染色分别观察gld和B6小鼠MCAO术后炎症细胞（星形胶质细胞、小胶质细胞、中性粒细胞、T细胞）和神经元的凋亡情况。分别给B6，gld小鼠侧脑室注射小剂量LPS（1ug）制备脑炎模型，荧光定量PCR检测其炎症因子和趋化因子的改变。免疫荧光观察在LPS诱导的脑炎模型中（不是MCAO）B6和gld小鼠细胞凋亡情况；免疫组化观察两组小鼠星形胶质细胞、小胶质细胞、中性粒细胞的表达。结果：1)缺血后炎症反应的程度和梗死灶的体积密切相关，较小的梗死体积同时也伴随减轻的炎症反应。因此gld小鼠卒中后炎症反应减弱有可能是继发于脑梗死体积减小的结果而不是FasL突变直接抑制炎症的原因。为了阐明这个问题，我们增加了一组小鼠模型，即在B6小鼠MCAO术前24h给予腹腔注射LPS（i.p0.5mg/kg)，通过LPS预处理减小缺血后脑梗死体积，模拟和gld小鼠类似的缺血脑保护作用，再比较三组小鼠（B6，gld和LPS预处理+B6）在MCAO后24h的脑梗死体积以及中性粒细胞浸润情况。我们的结果表明LPS预处理+B6组小鼠减少缺血梗死体积的程度和gld小鼠类似，但是脑组织中性粒细胞浸润数量却比gld小鼠显著增多。对脑梗死体积与中性粒细胞浸润的拟合曲线研究发现，B6MCAO组与LPS预处理+B6MCAO两组小鼠的拟合曲线斜率基本一致，而gld MCAO组小鼠斜率降低，说明FasL突变抑制中性粒细胞浸润数量远超过脑梗死体积减少伴随的中性粒细胞减少。2)由于卒中后缺血脑损伤程度与细胞凋亡密切相关，因此FasL突变的gld小鼠炎症反应减轻有可能是继发于细胞凋亡减少的结果，包括炎症细胞和神经元细胞凋亡减少而非FasL的直接抑炎作用。为了阐明这个问题，我们采用Annexin V染色代表细胞凋亡，NeuN染色代表神经元。免疫荧光双染显示Iba1，GFAP，MPO，CD3与Annexin V染色基本不重合，说明不论是B6还是gld小鼠MCAO后炎症细胞（小胶质细胞、星形胶质细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞）并不发生显著凋亡。而Annexin V与NeuN部分重合说明缺血后神经元发生细胞凋亡，且FasL突变的gld鼠神经元凋亡较B6鼠减少。3)上述结果表明B6小鼠缺血后神经元凋亡显著增多而gld小鼠神经元凋亡较少。为了排除FasL突变的gld小鼠炎症反应减轻是继发于神经元凋亡减少的这种可能性，我们采用了另一种脑组织炎症模型（不做MCAO），即侧脑室注射（ICV）小剂量LPS（1ug）。文献报道和我们的实验结果都证实ICV LPS诱导的脑炎模型能引起脑组织大量免疫炎症反应，却并没有显著的神经元细胞凋亡。在上述LPS脑炎模型中gld小鼠的炎症因子mRNA和炎症细胞浸润较B6鼠显著下降，这同第一部分MCAO模型的结果一致。结论：FasL能直接诱导卒中后炎症反应，而非细胞凋亡的继发作用。1）FasL突变直接抑制外周中性粒细胞浸润，而非脑梗死体积减小的继发结果。2）FasL突变抑制卒中后炎症反应，此作用不依赖于炎症细胞凋亡。3）FasL突变抑制LPS诱导的脑组织免疫炎症反应，此作用与神经元凋亡无关。第三部分FasL诱导卒中后炎症反应的病理机制目的：探讨FasL诱导卒中后炎症反应的病理机制和细胞内信号通路，寻找卒中治疗的潜在靶点。方法与材料：高速离心（100,000g，60min）法提取皮层脑组织胞质蛋白检测可溶性FasL（sFasL）；皮层脑组织全蛋白提取检测MAPK信号通路。免疫印迹Western blot法检测sFasL表达及JNK/ERK/P38蛋白及其磷酸化水平。免疫荧光双染检测缺血后Fas蛋白在星形胶质细胞上的表达情况。结果：1）在缺血再灌注24h时间点，B6小鼠sFasL蛋白表达较假手术组上升至451.67%，而FasL突变的gld小鼠sFasL表达较B6小鼠下降了62%，说明sFasL可能参与FasL的炎症作用。2）MAPK信号通路的激活与缺血后炎症反应密切相关。我们研究发现磷酸化的JNK与ERK通路在缺血卒中的B6小鼠显著增加，而FasL突变仅能够抑制JNK通路的激活，并不影响磷酸化的ERK和p38。3）卒中后FasL诱导免疫炎症反应与JNK通路的激活相关，而JNK通路亦是FasL反向信号传导活化T淋巴细胞的重要信号通路。脑缺血时，T淋巴细胞脑组织浸润后首先遭遇到星形胶质细胞，星形胶质细胞是脑组织中最重要的抗原递呈细胞，也是表达Fas的主要细胞。因此我们接下来检测了脑缺血后Fas在星形胶质细胞上的表达，发现GFAP+星型胶质细表面Fas表达明显增多，提示脑缺血后星形胶质细胞高表达Fas可激活FasL反向信号促进T淋巴细胞的增殖活化，诱导缺血性卒中的免疫炎症反应。结论：1）可溶性因子sFasL和磷酸化的SAPK/JNK蛋白在缺血侧皮层表达下降，提示FasL的促炎作用可能与sFasL的释放和JNK信号途径的激活相关。2）脑缺血后星形胶质细胞高表达Fas可能通过激活FasL的反向信号促进T淋巴细胞的增殖活化。3）临床上抑制FasL的表达可发挥抗炎作用改善卒中患者的预后，作为潜在的脑保护治疗的药物靶点。综上所述，本研究的主要创新之处在于：1、FasL诱导缺血性卒中后炎症反应，而FasL突变能抑制炎症反应保护缺血性脑损伤。2、FasL直接诱导卒中后免疫炎症反应，包括上调炎症因子mRNA表达，激活中枢胶质细胞，趋化外周中性粒细胞浸润以及调节T淋巴细胞亚群等；且FasL诱导炎症反应的作用不依赖其前凋亡作用。3、FasL诱导卒中后免疫炎症反应的分子机制可能与上调sFasL的表达以及激活磷酸化的MAPK/JNK通路相关。