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水稻(OryzasativaL.)是一种重要的粮食作物,为世界上一半以上人口提供主食。然而由于病虫害的频繁发生,使水稻生产遭受了严重的损失。为了解决水稻生产中高产、稳产、多抗的问题,以当前最有推广潜力和应用价值的超级杂交稻E32/培矮64S、9311/培矮64S、P88S/9311和P88S/0293为研究对象,探讨将多个抗病虫基因联合导入上述超级杂交稻亲本的基因组中,综合提高其抗病抗虫能力的可能性。
首先在E32、9311、0293和P88S这4种籼型超级杂交稻亲本中分别建立了一套高效的愈伤组织诱导和植株再生体系,优化了其各自的组织培养条件和培养基配方,从上述水稻品种的成熟种子中诱导得到了大量状态良好的Ⅰ、Ⅱ型胚性愈伤组织。这类愈伤组织在无选择压力的再生培养基上,其再生成苗率可以达到或接近100%。
其次在上述水稻品种中建立了高效的多基因转化系统,通过选择合适的受体材料和组织培养条件、提高DNA浓度和金粉分散程度、调整基因枪轰击的强度和参数等方法,使多基因载体在上述水稻中的转化率大大提高。应用上述基因枪转化方法,得到转4~10个外源基因的转基因超级杂交稻亲本(包括E32、9311、0293和P88S在内)共192个株系1243棵植株。
对上述转基因植株及后代的Southernblot和PCR分子检测结果表明:上述多个外源抗病虫基因可共整合到水稻受体基因组中并稳定传代。4~5价多基因表达载体(约24kb)上全部外源基因共整合的频率高达95.7%~100%。在基因枪转化的水稻植株中,多拷贝和重排频繁出现。多个拷贝的外源基因通常整合在1~2个位点上。
对部分转基因植株及其后代进行了northernblot和外源基因编码蛋白的酶活性检测,结果证明多个外源基因多可同时表达,外源基因在上述转基因水稻中拷贝数的多少和基因的表达量高低并没有必然的联系,多拷贝整合与重排也不一定会导致基因沉默的发生。
通过室内人工接种和大田抗病虫生物学鉴定,目前已在转多价抗病虫基因的超级杂交稻亲本中,选育到了至少3个高抗(0~1级)稻瘟病(Magnaporthegrisea)多个生理小种的9311纯系(R5代),1个同时高抗稻瘟病和纹枯病(Rhizoctoniasolani)的E32纯系,1个对白叶枯病(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)、稻瘟病、稻纵卷叶螟[Cnaphalocrocismedinalis(Guenée)]的抗性同时有了提高的E32转基因株系,以及一大批对稻纵卷叶螟、稻瘟病抗性有不同程度提高的E32和9311转基因植株。其中部分株系对稻纵卷叶螟和稻瘟病同时显示出抗性提高的特征。此外,转多价抗真菌病基因的9311植株和培矮64S原种配制的杂种F1代也表现出对稻曲病(Ustilaginoideavirens)和稻粒黑粉病(Tilletiabarclayana)具有较强的抗性。在上述的多数转基因植株中,其生长发育情况和主要农艺性状与原种相比均保持正常。
综上所述,通过应用多基因转化和改良策略已经获得了大量具有应用价值的抗病虫转基因超级杂交稻亲本。今后,通过进一步和常规育种结合,将很可能得到具备多种抗病虫性而农艺性状又良好的新型转基因超级杂交稻。