E2F3在皮肤黑色素瘤中的数据挖掘与初步功能研究

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目的:
  皮肤恶性黑色素瘤是一类致死率高、进展速度快的皮肤恶性肿瘤。其发病机制还尚未明确。目前认为黑色素瘤的发生是由于紫外线辐射等环境因素及个人史、家族史的共同作用引起抑癌基因的下调或致癌基因的激活,使黑色素细胞获得增殖能力导致的。从黑色素细胞到黑色素瘤的过程中涉及大量的基因组学改变和代谢组学的变化。
  E2F转录因子家族被认为与肿瘤有关的细胞增殖调控能力有关。该家族由E2F基因编码,受视网膜母细胞瘤蛋白的调控在细胞周期的调控及抑癌功能上发挥重要作用。我们希望通过对黑色素瘤A375细胞系进行细胞实验,并对皮肤黑色素瘤中E2F家族的相关信息进行挖掘,为探究E2F3在黑色素瘤发生过程中的作用提供参考。
  方法:
  基于实体肿瘤细胞基因突变目录(The Catalog of Cancer somatic Mutations, TCGA)可视化网站和组织基因型表达可视化网站(Genotype-tissue Expression Dataset Projects),使用GEPIA、GSCALite、LinkedOmics、TIMER和Metascape可视化网站,对E2F家族各成员的表达水平、预后相关性、基因突变类型、功能富集、药物敏感性等情况进行了分析。基于以上分析的结果以及相关的文献资料,我们推测黑色素瘤的发生与E2F3的高表达有关。为了验证这一猜想,我们首先检测黑色素瘤A375细胞中E2F3的表达情况。然后对E2F3基因进行敲减,使E2F3基因表达沉默,并用实时荧光定量PCR和WesternBlot检测E2F3的表达,然后进行细胞功能实验检测细胞凋亡情况、所处的细胞周期和细胞侵袭能力。
  结果:
  生物信息学分析结果发现,E2F3在黑色素瘤细胞中表达增加,且表达水平增高与患者的总体生存率及无病生存率存在负相关关系。结合文献资料,我们筛选出E2F3作为我们的初步研究对象。为了验证E2F3在黑色素瘤中的作用,首先对黑色素瘤A375细胞系中E2F3基因的表达进行检测,发现黑色素瘤A375细胞中E2F3mRNA和蛋白质均有表达。敲减E2F3后两者表达量均降低,细胞凋亡受抑制,阻滞在细胞周期G1期的细胞比例增加且肿瘤细胞侵袭能力降低。另外,我们对皮肤黑色素瘤中E2F家族的药物敏感性、基因突变类型以及功能及肿瘤相关通路进行了数据挖掘。分析结果提示黑色素瘤中E2F家族的突变类型以错义突变为主,通常在凋亡及细胞周期相关的肿瘤调控通路中表达,与细胞有丝分裂相关的基因呈正相关关系,GO功能富集在细胞核有丝分裂、细胞周期检查点,KEGG通路富集在细胞周期相关通路。E2F3的表达水平与CD8+T细胞以及嗜中性粒细胞具有一定的相关性,E2F3的拷贝数突变增加能够在一定程度上抑制树突细胞的免疫细胞浸润。
  结论:
  生信分析及细胞实验提示E2F3基因在黑色素瘤细胞中表达增加,对E2F3进行基因敲减后,细胞凋亡率增加、侵袭性降低,阻滞于细胞周期G1期的细胞增多。提示E2F3的表达能够抑制细胞凋亡,增加肿瘤细胞侵袭性,维持细胞周期的正常进行。另外,黑色素瘤中的E2F3拷贝数突变增加可能抑制免疫细胞浸润,影响患者的预后。
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