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结核病（tuberculosis，TB）是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引发的严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病。近些年来，由于耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）的流行及MTB与人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）共同感染等原因，古老的结核病再次成为全球面临的严峻的公共卫生挑战之一。然而，目前诊断结核病的金标准依然是罗氏固体培养，尚无有效、快速诊断结核病的方法。同时，研究已证实BCG的保护效果不理想，特别是对成年人结核几乎无预防效果。结核分枝杆菌特异性蛋白及其抗原表位的研究，在开发结核病新型诊断方法和研究有效的结核病新疫苗中具有着重要的作用。 本研究采用两种方法开展了结核分枝杆菌特异性抗原及人 T细胞表位的研究，以期发现最佳的新T细胞抗原，为后续诊断试剂和疫苗研究提供基础。一方面采用生物信息学方法，排除PE/PPE家族蛋白、转座子及已知抗原表位，对余下的所有蛋白进行系统、全面的人T细胞表位预测，并从中筛选优势表位进行生物合成。合成的表位，采用酶联免疫反应斑点法（ELISPOT）进行初步及扩大样本量两步验证。同时对表位集中的预测抗原及已知表位信息的特异性抗原，根据其编码基因序列设计引物，分子克隆方法获得重组质粒后，转化入原核表达系统进行表达，经Ni亲和柱亲和层析方法纯化，得到各重组蛋白。若重组蛋白为包涵体表达形式，采用透析复性以恢复天然构象。最后，建立最佳血清及抗原浓度的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，初步评价重组蛋白的抗原性。 利用TEPredict和IEDB两个软件同时预测出了273个抗原蛋白的2726个表位，从中筛选出评分大于5的50个表位，主要分布于Rv1798、Rv0197、Rv0658c、Rv2942及Rv3239c5个抗原。经进一步表位优化，获取分布于5个抗原上的32条多肽，由生物公司合成并纯化。采集结核病人血，分离得到外周血单个核细胞（PBMC），ELISPOT方法进行初步筛选。经10个细菌学阳性病人血样本对每条多肽的筛选，获得6条阳性多肽。对于阳性肽再使用50个细菌学阳性的结核病人及60个肺部病人和60个健康人作为对照进行验证。单条肽Rv1798-1、Rv1798-2、Rv0197、Rv0658c、Rv2942、Rv3239c的灵敏度分别为12.0％、18.0%、20.0%、8.0%、10.0%、4.0%，特异度均在99%以上。抗原Rv1798两条多肽联合灵敏度为24.0%，而特异度达到100%。由此可见，多肽联合用于结核病的诊断价值，远远高于单条多肽。 同时，我们选择了10个特异性蛋白抗原进行分子克隆及原核表达。本研究成功构建了相应抗原的重组质粒，表达纯化得到GroES、LpqH、PstS3、PPE18、PPE19、GlnA1、PlcA和EccA58种重组蛋白（其中两个重组质粒未表达成功）。进一步采用ELISA方法评价了这些蛋白在血清学中的诊断价值。抗原GroES、PPE18、PPE19、GlnA1及EccA5的诊断价值较高，曲线下面积（AUC）大于80%，其中灵敏度分别为72.1%、76.8%、59.0%、66.8%、66.8%，特异度分别为81.4%、78.4%、92.2%、78.4%、83.3%。抗原LpqH、PstS3和PlcA的AUC也均大于70%，其灵敏度分别为66.3%、52.1%、75.3%，特异度分别为68.6%、88.2%、65.7%。 综上所述，本研究首次采用TEPredict和IEDB两个软件同时对结核分枝杆菌毒力相关抗原进行系统全面的人T细胞表位预测，验证出6条结核分枝杆菌人T细胞表位多肽。同时通过分子克隆表达纯化和血清学验证，获得GroES、LpqH、PstS3、PPE18、PPE19、GlnA1、PlcA和EccA58个具有较好的抗原性蛋白，有望成为结核感染免疫诊断和新疫苗研究的候选者。