论文部分内容阅读
研究背景功夫菊酯（lambda-cyhalothrin,LCT）是目前被广泛应用的一种II型拟除虫菊酯类农药,具有神经毒性。本课题组前期研究发现对于行卵巢切除的青春期小鼠,LCT或雌激素（17β-Estradiol,E2）均能够提高小鼠海马突触后致密蛋白95（Post-synaptic Density 95,PSD95）的蛋白表达且改善小鼠的学习记忆能力,而当LCT与E2共同作用时,各自的单独效应均不显示。前期在培养原代小鼠海马神经元的研究中发现,雌激素受体α（Estrogen Receptorα,ERα）介导的AKT通路在LCT抑制雌激素的促神经突起生长（表现为数目增加）和促PSD95表达中起重要作用。脑源性神经营养因子（Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF）可调节神经元的存活和生长以及突触发育,是E2神经保护的重要效应分子。BDNF的表达受ERα-AKT、MAPK及PKA等多条信号通路调控。LCT虽然可干扰ERα-AKT通路,但并非必然影响BDNF。本课题拟探讨BDNF通路是否参与到LCT干扰雌激素的神经发育效应中。目的:以小鼠海马神经细胞系HT22细胞为体外模型,和行卵巢切除术ICR雌鼠为体内模型,研究BDNF通路在功夫菊酯（LCT）干扰雌激素促海马PSD95表达以及促海马功能中的作用。方法:以小鼠海马神经细胞系HT22细胞为模型,用LCT（50μM）、E2（10 n M）、LCT（50μM）+Trk B FC（BDNF信号通路的抑制剂,20μg/ml）、E2（10 n M）+Trk B FC（20μg/ml）、LCT（50μM）+ICI182 780（ERα抑制剂,1μM）、E2（10 n M）+ICI182 780（1μM）、LCT（50μM）+E2（10 n M）处理24h,MTT法检测细胞活性,免疫蛋白印迹法检测PSD95蛋白表达,ELISA法检测培养上清和细胞的BDNF蛋白水平。对出生后28天（PND28）的雌鼠行卵巢切除术（OVX）,恢复7天后,随机分为8组,每组10只,分别为:OVX+DMSO,OVX+LCT（3.0μg/g）,OVX+E2（10.0μg/g）,OVX+LCT（3.0μg/g）+K252a（BDNF信号通路的抑制剂,25μg/kg）,OVX+E2（10.0μg/g）+K252a（25μg/kg）,OVX+LCT（3.0μg/g）+E2（10.0μg/g）,Sham+DMSO,Sham+LCT（3.0μg/g）。腹腔注射给药,每天一次,连续7天,末次给药24小时后,各组中随机抽取5只小鼠进行行为学实验（旷场实验和Morris水迷宫）,余下部分用于免疫蛋白印迹法检测PSD95蛋白表达,ELISA法检测海马中BDNF蛋白水平。结果:在HT22细胞系体外培养模型中,发现LCT处理HT22细胞24h后,出现类似E2作用的效应。LCT显著提高HT22细胞PSD95蛋白的表达,用ICI182 780后这种增强效应消失。且LCT处理组与E2处理组之间细胞PSD95表达无统计学差异,提示LCT因其拟雌激素特性影响神经元PSD95表达。ELISA法检测发现,各处理组HT22细胞内BDNF蛋白水平无明显改变,而培养上清中BDNF蛋白有明显差异,提示BDNF蛋白表达受到影响。对BDNF m RNA的检测结果与培养上清ELISA法检测结果一致,说明LCT及其与E2联合作用可影响BDNF表达。实验发现,LCT具有类似E2的促BDNF表达效应,且可被ERα的经典核受体抑制剂ICI182 780所阻断。实验还发现,LCT或E2对神经元PSD95表达的促进效应均可被BDNF受体抑制剂Trk B FC所抑制,说明BDNF在LCT和E2对PSD95表达的影响中起到重要作用。ERα抑制剂和BDNF受体抑制剂对E2或LCT促PSD95表达效应的影响之间没有统计学差异,进一步说明BDNF通路在雌激素神经保护效应以及LCT干扰雌激素的这种效应中起重要作用。在ICR雌鼠OVX模型中同样发现类似体外模型的效应,OVX处理显著降低海马PSD95和BDNF的蛋白表达,OVX+DMSO组与Sham+DMSO组相比,海马PSD95和BDNF蛋白水平明显下降,而补充雌激素后这种降低效应得以改善,OVX+E2组与Sham+DMSO组相比无显著差异;OVX+E2组与OVX+DMSO组相比,海马PSD95和BDNF蛋白明显升高。与雌激素作用相似,LCT能够显著提高海马PSD95和BDNF蛋白表达,OVX+LCT组与OVX+DMSO组相比,海马PSD95和BDNF蛋白水平明显增加;OVX+LCT组与OVX+E2组相比,海马PSD95和BDNF蛋白水平无明显差异。而BDNF受体Trk B的抑制剂K252a可抑制LCT和E2对海马PSD95的促进作用,也进一步证明BDNF在LCT和E2对PSD95表达的影响中起到重要作用。LCT能够明显干扰E2对PSD95和BDNF的促进作用,OVX+LCT+E2组与OVX+E2组、Sham+LCT组与Sham+DMSO组相比,海马PSD95和BDNF的蛋白水平明显降低。在旷场实验中发现OVX处理显著减少小鼠的自主运动能力,OVX+DMSO组与Sham+DMSO组相比穿越总格数减少,而补充雌激素后这种降低效应消失,OVX+E2组与Sham+DMSO组相比无显著差异,OVX+E2组与OVX+DMSO组相比穿越总格数明显增加。这充分说明雌激素能够改善小鼠的自主运动能力;与雌激素作用相似,LCT单独作用能够显著增加穿越总格数,OVX+LCT组与OVX+DMSO组相比穿越总格数明显增长,OVX+LCT组与OVX+E2组相比穿越总格数无明显差异,这说明LCT单独作用时对小鼠的自主运动能力表现出拟雌激素效应;而BDNF受体Trk B的抑制剂K252a能够抑制LCT和E2的单独效应,OVX+LCT+K252a组与OVX+LCT组相比、OVX+E2+K252a组与OVX+E2组相比穿越总格数明显减少,BDNF通路在雌激素维持小鼠正常行为以及LCT干扰雌激素的这种效应中起重要作用。在存在雌激素的状态下,LCT能够明显干扰E2对穿越总格数的影响,OVX+LCT+E2组与OVX+E2组、Sham+LCT组与Sham+DMSO组相比穿越总格数明显减少。同样,在水迷宫实验中OVX处理显著延长登台潜伏期和缩短在目标象限的时间,OVX+DMSO组与Sham+DMSO组相比登台潜伏期明显延长,在目标象限的时间明显缩短,而补充雌激素后上述效应消失;与雌激素作用相似,LCT单独作用能够显著缩短登台潜伏期时间和延长在目标象限的时间;BDNF受体Trk B的抑制剂K252a能够抑制LCT和E2的单独效应,LCT+K252a组与OVX+LCT组、E2+K252a组与OVX+E2组相比登台潜伏期明显延长,目标象限的时间明显缩短;LCT能够明显干扰E2对登台潜伏期和目标象限时间的影响,OVX+LCT+E2组与OVX+E2组、Sham+LCT组与Sham+DMSO组相比登台潜伏期明显延长,在目标象限的时间明显缩短。结论:BDNF通路在E2促进神经元PSD95表达中起重要作用,虽然LCT单独作用时具有拟E2的效应,但LCT可通过干扰BDNF通路抑制E2对海马PSD95表达的促进作用,进而影响小鼠海马自主活动和学习记忆能力。