研究背景作为心脏细胞的主要构成成员,心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)约占心脏细胞数量的70%。CFs是心脏结构和生理功能的重要载体,直接参与心脏发育、心脏结构组成、细胞信号转导等正常生理过程。同时CFs涉及多种心血管疾病的病理生理过程,例如高血压(hypertension)、糖尿病心肌病(diabetic myocardiopathy)、心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, I/RI)、心肌梗死(myocardial infarction, MI)和心力衰竭(heart failure, HF)等多种疾病引起的心脏重构。CFs的异常增殖、金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)分泌失衡和心肌细胞外基质(extracellular matrixc, ECM)的过度沉积,所导致的心肌间质纤维化是心脏重构的主要病理基础。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)在心肌间质纤维化和心脏重构中起着至关重要的作用,其中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, ANGⅡ)是RAAS中主要的活性物质。病理情况下,例如MI时,ANG Ⅱ通过自分泌和旁分泌等方式刺激CFs增殖并促进Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)合成来修复受损的心肌组织,但CFs过度增殖所造成collagen Ⅰ持续反常合成与TGF-β和MAPKs的长时间激活,会引起心肌间质纤维化,导致心室顺应性降低,最终影响心脏的舒张和收缩功能。防治心肌间质纤维化,寻找有效作用靶点,已成为心血管疾病治疗亟待解决的重点和难点。MicroRNAs (miRNAs, miRs)是一类长度为18～25个核糖核苷酸组成的、且由生物体自身产生的非编码蛋白质的单链小分子RNA。miRs的主要作用机制是通过促进目的靶基因mRNA的降解或者抑制靶基因的翻译从而在转录后水平负调控靶基因的表达。miRs的主要功能为调节生命进程的基本环节,如细胞生长、分裂、增殖以及衰老等。新近研究发现,miRs与多种疾病的发生发展密切相关。已有研究表明,miRs通过调控其下游相关靶基因,广泛参与多种心血管疾病的病理生理发生发展过程。例如miR-21、miR-27、miR-29等均能通过下调其相应靶基因的表达和功能,参与调控心肌纤维化。miR-7是存在于哺乳动物体内的高度保守的miR,有两个亚型,即miR-7a和miR-7b。研究表明,miR-7在肿瘤细胞的生长、增殖、分化中起着重要的作用。新近研究发现在心血管疾病中,也存在miR-7的异常表达：miR-7与冠状动脉疾病发生风险相关：在心脏I/RI和儿童HF中miR-7的表达异常；在主动脉缩窄动物模型中,miR-7a在术后第五天表达下降,第二十天回到基线值；过表达miR-7a/b能减轻大鼠心脏I/RI所致的心脏损伤。此外,在皮肤成纤维细胞中miR-7还能直接调控collagen Ⅰ的生成。这些研究结果提示,miR-7a/b有可能通过作用于CFs影响collagen Ⅰ的生成,参与调控心肌纤维化进程,成为治疗心肌纤维化的新靶点。转录因子Spl (specific protein 1)隶属于Sp蛋白家族(Spl-Sp8),是其中最受关注的成员,通过与靶基因启动子上的GC区(GC或GT盒)结合和／或其他蛋白质的相互作用来调节靶基因的转录。Sp1参与多种基因的基础表达,同时与细胞的增殖、分化,炎症修复、凋亡以及纤维化等过程密切相关。Sp1能直接调控MMPs的转录,亦可通过TGF-β等途径间接调控MMPs的表达。Sp1还可直接结合于collagen Ⅰ启动子的GC盒和TCCTCC模体,从而激活collagen Ⅰ的转录和翻译。基因敲除Sp1或者应用药物mithramycin抑制Sp1的DNA结合活性都能明显减少collagen Ⅰ的合成。研究发现,在应用ANGⅡ构建的动物高血压模型的心脏中,以及ANGⅡ刺激的成年小鼠CFs中,Sp1都被激活,在心肌纤维化进展中发挥了重要的作用。而Sp1在大鼠乳鼠CFs中的表达与作用尚不清楚。此外已有研究报道Sp1是miR-7的靶基因。因此,本研究利用ANGⅡ刺激大鼠乳鼠CFs,通过干预miR-7a/b表达来探讨miR-7a/b在心肌间质纤维化中发挥的作用及其可能的机制。本研究分三部分进行：第一部分：miR-7a/b对ANGⅡ诱导的心肌成纤维细胞合成collagen Ⅰ的调控作用及其机制；第二部分：miR-7a/b参与调控Spl在心肌成纤维细胞中的作用及其机制；第三部分：miR-7a/b在小鼠心肌梗死引起的心肌间质纤维化中的作用。第一部分：miR-7a/b对ANGⅡ诱导的心肌成纤维细胞合成collagen Ⅰ的调控作用及其机制研究目的1.明确ANGⅡ能否诱导大鼠乳鼠CFs中collagen Ⅰ和miR-7a/b表达发生变化；2.研究miR-7a/b对ANGⅡ刺激下CFs合成collagen Ⅰ的影响及其机制；3.探讨miR-7a/b在ANGⅡ刺激的CFs中发挥作用的信号转导机制。研究方法1.细胞的培养取2-3天的Wistar大鼠乳鼠,开胸取心脏,将心脏剪碎成约1 nM3大小组织块,应用Ⅱ型胶原酶多次消化并收集细胞,差速贴壁1.5 h后弃去旧培养基,加入新的培养基,在37。C恒温培养箱中培养CFs。应用CFs特异性标志物vemintin鉴定CFs纯度,并选取2-3代CFs作为研究对象。2. miR-7a/b的过表达和沉默使用Lipofectamine 2000将miR-7a/b mimics转染入CFs以实现miR-7a/b的过表达,将miR-7a/b inhibitors转染入CFs以实现miR-7a/b的沉默,以scrambled siRNA作为对照组。荧光显微镜观察转染效率,实时定量逆转录PCR测定miR-7a/b表达水平以检测转染效果。3.激光共聚焦显微镜检测应用细胞免疫荧光法检测CFs中vemintin、α-actin以及CD31的表达情况。4.蛋白印迹收集各组细胞提取蛋白,分别检测collagen Ⅰ、MMP-2、MMP-9、TGF-β、 ERK、p-ENK、JNK、p-JNK、p38和p-p38蛋白表达水平的变化。5.实时定量逆转录PCR使用Trizol提取各组细胞总RNA,进行逆转录和实时定量PCR检测CFs中collagen I的mRNA表达水平。使用mirVanaTM miRNA提取试剂盒提取各组细胞的miRNAs,并进行逆转录,应用荧光标记的miR-7a/b特异性探针,检测CFs中miR-7a/b的表达水平。6.细胞的增殖和迁移采用四氮唑盐(MTT)比色法在酶联免疫检测仪OD540 nm处测定各孔的吸光度值,以检测CFs的增殖能力。利用Transwell小室观察计数CFs在ANGⅡ刺激下的迁移情况。7.明胶酶谱法采用明胶酶谱法检测CFs培养基上清中MMP-2和MMP-9的活性。8.双荧光素酶报告基因检测构建GV126-collagen Ⅰ 3’-UTR野生型(GV126-collagen Ⅰ 3’-UTR-WT)和突变型(GV126-collagen Ⅰ 3’-UTR-MU)报告基因载体,将miR-7a/b mimics和这些报告基因载体及海肾素表达质粒(pRL-TK vector)转染入CFs后,用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测并分析其荧光素酶活性,确定miR-7a/b的作用靶点。9.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,并以均数±标准差(x±s)表示,P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.CFs的鉴定荧光显微镜下CFs中vemintin表达阳性、CD31和α-actin表达阴性的细胞达90%以上,这一结果显示所培养的细胞确为CFs。2. ANGⅡ刺激CFs合成collagen Ⅰ分别应用100 nM ANGⅡ刺激CFs不同时间,collagen Ⅰ蛋白表达水平呈时间依赖性增高；用不同浓度的ANGⅡ刺激CFs 24 h后,collagen Ⅰ蛋白表达水平呈浓度依赖性增高。选用100 nM ANGⅡ刺激CFs 24 h为后续实验条件。3.100 nM ANGⅡ下调CFs中miR-7a/b的表达应用100 nM ANGⅡ刺激CFs 24 h后,qRT-PCR结果显示,与对照组相比,miR-7a和miR-7b表达水平明显降低。4. miR-7a/b参与调控ANGⅡ诱导CFs合成的collagen Ⅰ与阴性对照组(转染scrambled siRNA组)相比,转染miR-7a/b mimics后ANGⅡ诱导的collagen Ⅰ的高表达受到抑制。5. collagen Ⅰ是miR-7a的下游靶基因正常未经刺激的CFs中collagen Ⅰ蛋白的表达同样受到miR-7a/b的调控。miR-7a参与,但miR-7b不参与调控collagen Ⅰ mRNA的表达。双荧光素酶报告基因结果检测显示,collagen Ⅰ是miR-7a的下游靶基因。6. miR-7a/b调控MMP-2与MMP-9过表达miR-7a/b后,100 nM ANGⅡ诱导的MMP-2和MMP-9的蛋白高表达水平均降低。明胶酶谱结果显示过表达miR-7a/b抑制ANGⅡ上调的MMP-2的活性。7. miR-7a/b参与调控ANGⅡ刺激的CFs增殖和迁移MTT比色法结果以及Transwell结果显示,100 nM ANGⅡ刺激CFs后,CFs的增殖和迁移能力显著增强。过表达miR-7a/b后,CFs增殖和迁移能力则明显下降。8. miR-7a/b参与调控ANGⅡ激活的TGF-β和MAPKs通路100 nM ANGⅡ引起CFs中TGF-β高表达,同时明显增加CFs内ERK、JNK和p38磷酸化水平。过表达niR-7a/b降低TGF-(3的表达水平以及ERK、JNK、p38的磷酸化水平。研究结论1. ANGⅡ促进大鼠乳鼠CFs合成collagen Ⅰ,并下调miR-7a/b的表达水平；2.过表达miR-7a/b可降低ANGⅡ引起的collagen Ⅰ、TGF-β、MMP-2和MMP-9的高表达,降低ERK、JNK、p38的磷酸化水平,降低CFs的增殖迁移能力；3.CFs中miR-7a可直接调控collagen Ⅰ的表达,miR-7b则可能通过减少CFs增殖、移行,抑制TGF-β、MMP-2和MMP-9的表达以及MAPKs的激活来减少collagen Ⅰ的表达。第二部分：miR-7a/b参与调控Spl在心肌成纤维细胞中的作用及其机制研究目的1.研究Spl在ANGⅡ刺激的大鼠乳鼠CFs中的所发挥的作用；2.探讨miR-7a/b是否参与调控Spl在CFs中的作用。研究方法1.Spl活性的抑制应用不同浓度的Spl活性抑制剂mithramycin预处理CFs1h后再应用ANGⅡ刺激CFs 24 h,检测Spl和collagen Ⅰ的表达,选择最佳作用浓度进行下一步实验。2.激光共聚焦显微镜检测应用细胞免疫荧光法检测Spl和collagen Ⅰ在CFs中的分布。3.蛋白印迹收集各组细胞提取蛋白,检测ANGⅡ刺激CFs前后以及miR-7a/b mimics对Spl的影响。同时检测Spl活性抑制齐mithramycin对collagen Ⅰ、MMP-2、MMP-9、 TGF-β、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38和p-p38蛋白表达水平的影响。4.实时定量逆转录PCR使用Trizol提取各组细胞总RNA,进行逆转录和实时定量PCR检测CFs中Sp1 mRNA表达水平。5.细胞的增殖和迁移采用四氮唑盐(MTT)比色法在酶联免疫检测仪OD540 nm处测定各孔的吸光度值,以检测CFs的增殖能力。利用Transwell小室观察计数CFs在ANGⅡ下的迁移情况。6.明胶酶谱法采用明胶酶谱法检测CFs培养基上清中MMP-2和MMP-9的活性。7.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,并以均数±标准差(x±s)表示,P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1. miR-7a/b调控Sp1的表达未经刺激的CFs中过表达miR-7a/b后,Spl的蛋白水平降低,抑制miR-7a/b后Spl的蛋白表达水平上升。无论miR-7a还是miR-7b均不影响Sp1 mRNA的表达。应用100 nM浓度的ANGⅡ刺激CFs 24 h,Sp1蛋白表达明显增高,过表达miR-7a/b后Sp1的蛋白降低。细胞免疫荧光结果显示Sp1定位在CFs的细胞核内,collagen Ⅰ则定位在细胞质,miR-7a/b对二者定位无影响。2.抑制Sp1活性能减少CFs合成collagen Ⅰ与对照组(单纯ANGⅡ刺激组)相比,应用不同浓度的Sp1活性抑制剂mithramycin预处理CFs,均能减少CFs合成的collagen Ⅰ。100 nM mithramycin对collagen Ⅰ影响最明显。通过转染miR-7a/b inhibitors抑制miR-7a/b的表达,能部分抵消100 nM mithramycin对collagen Ⅰ合成的负调控作用。3.抑制Sp1活性能降低MMP-2的表达/活性以及MMP-9的表达与对照组(单纯ANG Ⅱ刺激组)相比,100 nM mithramycin预处理组MMP-2和MMP-9蛋白表达降低,细胞培养基上清中MMP-2的活性明显下降。与阴性对照组(转染scrambled siRNA+100 nM mithramycin组)相比,miR-7a/b沉默组细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达及MMP-2的活性上调。4.下调Sp1活性有效抑制CFs的增殖和迁移100 nM浓度的mithraymycin显著抑制100 nM ANGⅡ诱导的CFs的增殖和迁移,沉默miR-7a和miR-7b的表达后,mithraymycin对细胞增殖和迁移能力的抑制作用减弱。5.抑制Sp1活性下调TGF-β的表达和ERK的磷酸化与对照组(单纯ANGⅡ刺激组)相比,100 nM mithramycin预处理组TGF-(3蛋白表达及ERK磷酸化程度降低;mithramycin对JNK和p38的磷酸化水平无明显影响。与阴性对照组(转染scrambled siRNA+100 nM mithramycin组)相比miR-7a/b沉默组TGF-β蛋白表达和ERK磷酸化水平提高。研究结论1. ANGⅡ诱导大鼠乳鼠CFs高表达Sp1；2.抑制Sp1活性减少CFs合成的collagen Ⅰ,降低CFs增殖和迁移能力,并抑制MMP-2表达／活性、MMP-9和TGF-β的表达以及ERK的磷酸化。3. miR-7a/b抗纤维化的作用至少部分是通过调控Sp1来实现的。第三部分：miR-7a/b在小鼠心肌梗死引起的心肌间质纤维化中的作用研究目的1.明确小鼠梗死心肌组织中niR-7a/b表达是否发生变化；2.研究miR-7a/b是否能够影响心肌间质纤维化和心肌梗死后的心功能。研究方法1.心肌梗死模型的建立用1.5%异氟烷麻醉小鼠,固定后经口腔行气管插管,选取胸骨左缘第四肋间隙为开胸部位,进行操作。开胸后小心剪开心包,结扎冠状动脉左前降支(LAD),构建心肌梗死模型。2.慢病毒的转染方法及效果的测定结扎LAD后,用无菌微型注射器将20μl分别携带scrambled siRNA (GFP-NC)、miR-7a mimics (GFP-7a)、miR-7b mimics(GFP-7b)、miR-7a inhibitors (GFP-anti-7a)、miR-7b inhibitors(GFP-anti-7b)的慢病毒溶液分3点注射到不同组别小鼠心脏结扎部位周围心肌内,术毕逐层关胸。28天后行快速冰冻切片并将心肌组织冰冻切片置于荧光显微镜下检测病毒转染效率；留取组织应用实时定量PCR测定miR-7a/b的表达水平以确认转染效果。3.心脏功能的测定选取左室长轴标准切面留取心脏二维超声于M超图像测定左室收缩末期直径、左室舒张末期直径；并根据仪器自身内置的计算模块,计算出左室射血分数和左室短轴短缩率。4.蛋白印迹将心脏组织于冰上剪碎,以实现更完整提取蛋白。提取蛋白后用Western blot的方法检测miR-7a/b对MI后Spl和collagen Ⅰ表达的影响。5.实时定量逆转录PCR以实时定量PCR检测心肌组织中miR-7a/b的表达水平。6.组织学染色收集各组小鼠心脏并制备石蜡切片,进行Masson和天狼星红染色以显示心肌组织中胶原的含量。应用免疫组织化学染色,观察Spl和collagen I的表达情况。7.细胞凋亡的测定应用TUNEL试剂盒检测心肌细胞的凋亡情况。8.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,并以均数±标准差(x±s)表示,P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.MI引起miR-7a/b表达发生变化qRT-PCR结果显示MI后不同时间miR-7a/b的表达在梗死周围区心肌组织内呈现动态变化。2.慢病毒转染有效与转染携带scrambled siRNA的慢病毒的对照组(GFP-NC)相比,转染miR-7a/b mimics的慢病毒组(GFP-7a/b)中miR-7a/b的表达增高,转染miR-7a/b inhibitors的慢病毒组(GFP-anti-7a/b)中miR-7a/b的表达降低,干预效果达到要求。3.过表达miR-7a/b减轻MI引起的心肌间质纤维化结扎LAD后梗死周围区Sp1表达上调,过表达miR-7a/b下调Sp1蛋白表达水平；相反,沉默miR-7a促进Sp1表达,miR-7b对Sp1表达无明显影响。4.过表达miR-7a/b减轻MI引起的心肌间质纤维化结扎LAD上调梗死周围区collagen Ⅰ表达,引起心肌间质纤维化,过表达miR-7a/b下调collagen Ⅰ蛋白表达,减小纤维化面积。与之相反,沉默miR-7a/b加剧collagen Ⅰ的合成,增大纤维化面积。5.过表达miR-7a/b减少MI引起的心肌细胞凋亡过表达miR-7a/b减轻结扎LAD诱导的心肌细胞的凋亡。与之相反,沉默miR-7a/b后,发生凋亡的心肌细胞较GFP-NC组增多。6.过表达miR-7a/b改善MI引起的左室功能异常结扎LAD后,左室收缩末期直径、左室舒张末期直径增大,左室射血分数和左室短轴短缩率降低,过表达miR-7a/b改善这一状况,沉默miR-7a/b则加重心室的扩张程度与心功能的减退。过表达miR-7a/b改善MI引起的左室功能异常。研究结论1.小鼠心肌梗死组织中miR-7a/b表达呈现动态变化；2.过表达miR-7a/b能够减少心肌梗死引起的心肌细胞凋亡和心肌间质纤维化,改善心功能。