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骨关节炎（osteoarthritis,OA）是常见病、多发病,我国40岁以上人群患病率为38.46%。膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）是OA中发病率较高的类型,以膝关节疼痛、肿胀、功能活动受限为主要临床表现,且发病率随年龄增加而增加,严重影响生活质量,致残率高。目前的治疗手段多为对症处理,不能延缓病程的进展,最终常需要关节置换。细胞制剂关节腔内注射是近年来OA治疗的新趋势,临床研究展现了良好的临床效果、安全性及可行性。用于KOA关节腔内注射的细胞制剂主要有血小板制剂、单个核细胞制剂和干细胞制剂。血小板制剂治疗OA的效果,明显优于现临床关节内注射传统药物的方法,不良反应较少,但修复软骨损伤和改善疾病进程作用较弱,有效时间亦有限。干细胞腔内注射治疗OA是目前研究前沿与热点,是治疗OA效果最为理想的细胞类型,特别是在延缓病程进展、修复软骨损伤、促进软骨再生方面具有较好的治疗效果和安全性,且疗效维持时间长,但目前我国尚无干细胞产品问世,且干细胞制备程序复杂、周期长、费用昂贵、临床应用对医疗机构级别要求高,拟尽快使我国海量OA病人获得细胞制剂治疗的意愿难以实现。基于以上考虑,我们将注意点放在了单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）治疗OA的方向上。MNCs是指具有单个细胞核的细胞总称,包含有干、祖细胞等多种异质性细胞群。实验与临床研究发现,骨髓、脂肪源性MNCs关节腔内注射,具有减轻或消除骨关节炎的疼痛、改善关节的功能、阻止病程的进展、促进软骨的再生的作用,虽然促进软骨再生的作用弱于干细胞,但优于血小板制剂。与干细胞相比,MNCs获取操作简单、无需体外培养扩增、便捷、经济;对医疗机构的级别和设施要求较低;具有较好的有效性、安全性和可行性;可以作为医疗技术在临床广泛开展,但目前基础及临床仅开展了骨髓、脂肪源性MNCs治疗OA的研究。外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMNCs）是外周血中具有单个核的细胞,主要包括单核细胞,T、B淋巴细胞,巨噬细胞,树突状细胞等免疫细胞和干/祖细胞。干/祖细胞占单个核细胞的0.01%～0.10%,以造血干细胞为主,亦有部分间充质干细胞和内皮祖细胞。从PBMNCs组成成分上分析,PBMNCs含有大量抗炎细胞,应具有较好的抗炎作用;含有的干/祖细胞具有延缓OA病程进展、修复软骨损伤、促进软骨再生的作用,因此,利用PBMNCs治疗OA,从理论上推导,应当有效。特别是PBMNCs获取创伤小、方便、病人接受度高,无需体外培养扩增、便捷、经济,对医疗机构的级别和设施要求较低,符合国际上细胞制备最小干预原则,可作为医疗技术应用于临床。基于以上认识,我们提出了PBMNCs治疗OA的设想。本研究拟利用SD大鼠KOA模型,研究SD大鼠PBMNCs关节腔内注射对KOA的治疗作用,为临床开展PBMNCs关节腔内注射治疗KOA提供实验依据,并期望能培育一项OA治疗的新临床医疗技术。第一部分SD大鼠外周血单个核细胞的制备与检测目的:研究SD大鼠外周血的细胞种类、含量与人类的相似性,PBMNCs制备方法,PBMNCs中淋巴细胞、单核细胞、干/祖细胞含量,及年龄变化趋势;评估SD大鼠PBMNCs治疗KOA的实验研究对人类开展PBMNCs治疗KOA的参考意义,PBMNCs制备方法的可行性;及选取什么年龄组SD大鼠用于实验的合适性。方法:全自动血液分析仪检测3、6、12月龄SD大鼠外周血细胞的种类与含量。采用淋巴细胞分离液、不连续密度梯度离心法,制备3、6、12月龄SD大鼠PBMNCs,细胞计数仪检测PBMNCs中细胞种类、含量及淋巴细胞、单核细胞含量随年龄的变化趋势。流式细胞技术检测PBMNCs干/祖细胞含量及年龄变化趋势。结果:1、血常规检测,SD大鼠外周血细胞由白细胞、红细胞、血小板组成,白细胞又分为中性、嗜酸、嗜碱粒细胞和淋巴细胞、单核细胞,与人类一致。但与人体相比,淋巴细胞、血小板含量高,特别是血小板含量可比人类高2倍左右,单核细胞含量与人类相似。2、单个核细胞检测,采用淋巴细胞分离液,不连续梯度离心法制备PBMNCs,离心后不同细胞成分分层清晰,获得的PBMNCs主要成分为淋巴细胞、单核细胞和血小板,与人体PBMNCs成分相同;红细胞、粒细胞去除较完全,说明本研究采用的PBMNCs分离方法可行。PBMNCs中淋巴细胞、单核细胞含量随年龄的增长下降趋势明显。3、PBMNCs中干/祖细胞含量的检测,流式细胞技术检测SD大鼠PBMNCs中干/祖细胞的含量,发现,Nanog、OCT4、SOX2、SSEA4四种干性标志物均有表达,Nanog阳性表达量最低,SSEA4表达最高。四种干性标志物阳性细胞数的变化,总体趋势均为6月龄大鼠干/祖细胞含量最高。结论:以SD大鼠PBMNCs进行治疗OA的实验研究,对人类开展PBMNCs治疗OA临床研究,有一定参考价值。淋巴细胞分离液,不连续梯度离心法制备大鼠PBMNCs可行。拟进行SD大鼠PBMNCs治疗OA的实验研究,建议选6月龄以下大鼠为宜。第二部分PBMNCs腔内注射治疗KOA的效果目的:以改良Hulth法制备的SD大鼠KOA为模型,探讨SD大鼠PBMNCs关节腔内注射治疗KOA的疗效。方法:动物模型评估部分,采用部分切除内侧半月板、横断内侧副韧带的改良Hulth方法,制备SD大鼠KOA模型;造模后6周、7周、8周,采用von Frey纤维细丝和足底热辐射测痛仪测定大鼠机械痛阈值（paw withdrawal threshold,PWT）和热刺激疼痛阈值（thermal withdrawal latency,TWL）的变化;8周时处死大鼠,观察软骨组织的损伤情况。PBMNCs关节腔内注射治疗KOA疗效部分,造模6周后,每关节腔内注射50μl 1×106个细胞/ml的PBMNCs,每周一次,共四次,观测给药后2、3、4、5周时疼痛阈值变化;PBMNCs治疗后5周,处死动物,观察关节软骨损伤情况;并与玻尿酸（hyaluronate,HA）进行比较。结果:1、SD大鼠KOA模型评估本改良Hulth方法制备的SD大鼠KOA模型,疼痛阈值下降明显,关节软骨损伤严重,是一种制备SD大鼠KOA模型的可行方法。2、PBMNCs关节腔内注射治疗KOA的疗效SD大鼠PBMNCs关节腔内注射后2周,50%PWT自4.13上升至7.78,三周达高峰,后略有减低,效果优于HA治疗（P＜0.01）;TWL自9.55上升至12.88,三周达高峰,后略有减低,与50%PWT变化趋势一致,效果好于HA（P＜0.05或P＜0.01）。说明PBMNCs具有较好止痛效果,优于HA的疗效。PBMNCs关节腔内注射5周后,软骨病理学观测,关节软骨损伤程度明显低于模型组,接近正常软骨组织,效果明显好于HA治疗。结论:KOA模型大鼠PBMNCs关节腔内注射治疗,有明确的疗效,考虑PBMNCs获取方便、患者接受度高、无需体外培养、符合国际最小化干预原则、快捷、经济、应用不受医疗机构级别限制,我们认为可作为临床医疗技术进行研发。