肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居恶性肿瘤第五位、死亡率位居第三位。目前全球每年约有600,000新发病例以及500,000人死于HCC。我国HCC的发病数约占全球总数的43.7％。手术切除是HCC的首选治疗手段，但手术切除率仅为30％-40％；而且术后5年复发率高达80％，绝大多数复发性HCC无法再手术切除。对不能手术切除的HCC通常采用经导管肝动脉栓塞化疗(TACE)、局部消融治疗、化学治疗、分子靶向治疗等非手术治疗，但是总体效果依然欠佳。因此，积极寻找HCC有效的治疗手段具有重要的科学意义及临床价值。　　 随着肿瘤免疫学及分子生物学的快速发展，免疫治疗已成为肿瘤治疗领域的一个研究热点。树突状细胞是人体内功能最强的抗原递呈细胞，膜表面高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子，能移行至淋巴器官和刺激初始型T淋巴细胞增殖活化DC通过识别、摄取肿瘤抗原并加工处理，将抗原递呈给初始型CD4+T淋巴细胞，同时分泌高水平的IL-12，主导生成Th1型应答，辅助CD8+T淋巴细胞的CTL反应；同时DC还可以通过交叉递呈的方式将肿瘤抗原递呈给CD8+T淋巴细胞，生成抗原特异性效应细胞杀伤肿瘤细胞，形成抗肿瘤免疫应答。因此，以DC为基础的免疫治疗是目前抗肿瘤免疫治疗领域的研究重点之一。但是，肿瘤细胞通常为弱免疫原性且缺乏特异性肿瘤抗原，如HCC，不能有效刺激活化DC。如何使DC有效获取、呈递肿瘤抗原是成功建立特异性抗肿瘤免疫的关键。　　 癌睾丸抗原(cancer/testis antigens，CTA)是指仅在肿瘤组织以及睾丸、胎盘组织内表达的抗原。第一个CTA成员MAGE-Al是由Boon等人在1991年首次发现，目前已知由CTA基因编码转录的产物有超过100多种。由于CTA在睾丸组织外的正常组织内均不表达，以其为抗原所诱导的抗肿瘤免疫不会对正常组织产生不良影响，因此很适于作为肿瘤免疫治疗的靶抗原。但是，CTA的表达率差异和异质性对于对CTA疫苗的运用是一个很大的障碍。目前已有不少研究证明，CTA基因的表达是受表观遗传所调控。表观遗传是指在不改变DNA序列本身的情况下，通过DNA、组蛋白等的化学修饰影响基因的转录水平和表达，主要包括DNA甲基化和组蛋白去乙酰化等，其中DNA甲基化是基因表达调控的主要机制之一。Boon等发现，只有在启动子区CpG岛处于低甲基化状态的细胞株中才能检测到MAGE-1的mRNA表达，而经过去甲基化药物5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytine，DAC)处理后，所有MAGE-1启动子处于激活状态的细胞株均能表达MAGE-1基因。通过DAC处理肿瘤细胞可以使处于高甲基化状态的CTA基因去甲基化而促进其表达，从而增加肿瘤细胞的免疫原性。　　 经DAC诱导肿瘤细胞表达的CTA能否被免疫系统有效识别并产生相应的特异性免疫应答目前尚不清楚。本课题的目探讨经去甲基化剂DAC修饰后的肝癌细胞体外、体内诱导特异性抗肿瘤免疫反应的效能。　　 第一部分DAC修饰肝癌细胞诱导GAGE-1表达的研究　　 方法:　　 1.肝癌细胞株的培养　　 Hep3B细胞复苏后加入DMEM完全培养基吹匀后转入培养瓶中，置于37℃、含5％CO2及饱和湿度的培养箱中按常规方法传代培养。　　 2.肝癌细胞的DAC修饰　　 肝癌细胞株接种于6孔板，分别加入0.4μM、1μM和2.5μM的DAC培养，每24小时换液，共培养96小时，之后以常规培养基再培养24小时，收集细胞备用。　　 3.总RNA提取、RT-PCR　　 参照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行总RNA提取，RT使用Promega公司的逆转录试剂盒，按其说明书用随机引物进行。PCR按照标准反应体系进行，凝胶成像系统分析成像　　 4.Western blotting　　 DAC修饰后的肝癌细胞按常规方法提取总蛋白质、凝胶电泳、转膜后封闭、杂交、显影。　　 结论:DAC修饰后的肝癌细胞CTA基因GAGE-1表达量有明显的上升，且上升幅度依剂量递增。　　 第二部分DAC修饰肝癌细胞对树突状细胞活化T淋巴细胞效能的影响　　 方法:　　 实验方法:　　 1.Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞富含白细胞的buffy coat用0.9％NaCl稀释混匀，利用Ficoll密度梯度离心法分离出PBMC。　　 2.免疫磁珠分选单核细胞　　 PBMC使用MS磁珠分选系统和抗CD14磁珠按说明书操作分选出单核细胞。　　 3.免疫磁珠分选淋巴细胞　　 PBMC使用MS磁珠分选系统和Pan T Cell试剂盒按说明书操作用阴性选择法分选出淋巴细胞　　 4.树突状细胞的培养　　 单核细胞以DC液培养诱导其发育分化为DC。　　 5.紫外线诱导肿瘤细胞凋亡　　 经DAC处理后的Hep3B细胞吸去上清，紫外灯照射5分钟，继续培养8小时　　 6.凋亡的肿瘤细胞与DC共培养　　 按1∶5的细胞量加入凋亡Hep3B细胞至DC培养孔中，中培养18小时后加入LPS，继续培养24小时。　　 7.流式细胞仪检测细胞表面标记表达(细胞表面染色)　　 按常规方法收集细胞并染色，用流式细胞仪分析。　　 8.混合淋巴细胞反应(MLR)　　 前述DC和淋巴细胞的比例按1∶10混合培养2周后收集上清和细胞检测。　　 9.胞内染色(淋巴细胞)　　 收集细胞并按胞内染色法染色，用流式细胞仪分析。　　 10.ELISA检测细胞因子　　 收集的培养上清按ELISA试剂盒说明书操作检测IFN-γ浓度。　　 结论:　　 1.DAC修饰肝癌细胞所诱导表达的CTA可被树状突细胞吞噬并被有效地加工并提呈。　　 2.吞噬DAC修饰肝癌细胞的树状突细胞能有效活化同源T淋巴细胞。　　 第三部分DAC修饰肝癌细胞作为疫苗诱导小鼠产生特异性抗肝癌免疫　　 方法:　　 1.动物饲养与分组　　 C57BL/6J小鼠15只，于SPF级动物饲养室饲养，随机分为Control组、Hepa1-6组以及Hepa1-6-DAC组，每组5只。　　 2.肿瘤疫苗的制备与接种　　 分别收集DAC处理96小时的Hepa1-6细胞、未处理Hepa1-6细胞，MMC灭活后计数，HBSS重悬制备单细胞悬液，调整细胞浓度至2×107/ml，注射于小鼠右背部皮下，每只小鼠注射100μl，即2×106个细胞；以皮下注射HBSS为对照组。48小时后接种3.5×107个未经任何处理的Hepa1-6细胞于对侧皮下，测量计算肿瘤体积，绘制生长曲线。　　 3.脾细胞杀伤实验　　 处死小鼠取出脾脏分离得到淋巴细胞，按10∶1的比例加入MMC灭活的Hepa1-6或B16细胞的12孔板中，培养16小时。收集肿瘤细胞洗涤离心后用AnnexinV/PI双染法染色后上流式检测。　　 结论:　　 DAC修饰肝癌细胞疫苗可在小鼠体内有效诱导特异性抗肝癌免疫，有效抵御后续再次接种的同种肿瘤细胞的攻击。