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研究背景:目前,乳腺癌的发病率已经超过肺癌,成为全球最常见的癌症。尽管近年来乳腺癌的手术、化疗、内分泌治疗以及靶向治疗方法的应用提高了总体生存率。但对于侵袭性乳腺癌,例如三阴性乳腺癌,由于具有高侵袭性、浸润生长、化疗耐药以及免疫抑制性等不良特征,其治疗方式仍然有限。近年来,迅速发展的肿瘤免疫治疗领域正在为肿瘤治疗拓展新的视野。程序性死亡配体-1（又称B7-H1、CD274或PD-L1;以下简称PD-L1）是一种33 k Da的I型跨膜糖蛋白,通过与其受体即程序性死亡-1（PD-1）结合进而帮助肿瘤细胞逃避微环境中的宿主免疫监视以及下调T细胞功能等。目前,有报道称PD-L1免疫检查点抑制剂疗法对乳腺癌的临床疗效有限。这可能是由于PD-L1的表达在治疗过程中是动态的,这也可以部分解释为什么一些肿瘤缺乏PD-L1表达的癌症患者可以对检查点抑制剂治疗产生良好的反应。因此,探究乳腺癌中PD-L1表达的上游调控机制对于深入了解这类免疫抑制分子的功能非常重要。这可能为我们提供新的策略来减少细胞内PD-L1的表达丰度。表观遗传调控是调控分子表达的关键因素之一。RNA甲基化中N~6-甲基腺苷修饰是转录后修饰的一种类型,近年来获得了广泛的关注。作为哺乳动物中最普遍、最丰富的RNA甲基化修饰类型,N~6-甲基腺苷（m~6A）修饰是可逆的且动态的;甲基转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）以及甲基阅读蛋白（Readers）共同进行调控整个甲基化的修饰过程。它们与RNA分子的整体代谢密切相关,因为这种修饰操纵着RNA的剪切、稳定性、出核、翻译效率等重要的分子代谢过程。因此m~6A修饰也是连接转录和翻译的重要桥梁。最近的研究表明,m~6A修饰在免疫调控中也扮演重要角色。METTL3,作为主要的m~6A甲基化酶,以m~6A-YTHDF2依赖的方式调控STAT1和IRF1 m RNA的表达,也能通过调节结直肠癌微环境中的肿瘤浸润免疫细胞来改善免疫治疗反应。METTL3表达被抑制后能通过改变骨髓来源的巨噬细胞重编程而削弱抗PD-1治疗疗效。此外,去甲基化酶FTO介导的m~6A修饰与黑色素瘤肿瘤发生的和对抗PD-1治疗的抗性有关。然而,m~6A修饰对乳腺癌免疫检查点分子表达的影响以及参与肿瘤免疫逃逸的效应仍不清楚,需要进一步深入研究。研究目的:本研究的目的是明确m~6A修饰是否在调节PD-L1的表达中起关键作用,并揭示具体的分子机制。具体内容如下:（1）鉴定METTL3介导的m~6A修饰调控PD-L1表达以及RNA稳定性;（2）验证IGF2BP3作为阅读蛋白参与调节METTL3介导的PD-L1m~6A修饰;（3）证实体外功能实验中METTL3-IGF2BP3轴通过PD-L1表达对肿瘤免疫监视的影响;（4）揭示METTL3在不同动物模型中对肿瘤微环境的作用;（5）阐明PD-L1表达与METTL3或IGF2BP3表达在组织芯片中的相关性。研究方法:1.通过m~6A表观芯片、Me RIP-seq、表达谱数据分析METTL3介导的m~6A修饰的下游靶点情况;在四种乳腺癌细胞系中,利用RIP-q PCR、Me RIP-q PCR检测,证实METTL3与PD-L1 m RNA直接结合关系以及m~6A修饰PD-L1 m RNA;构建位点突变质粒以及应用荧光素酶报告基因,分析PD-L1 m RNA上面的具体修饰位点信息;通过绝对定量PCR检测,进一步验证METTL3介导每一个位点的具体m~6A甲基化水平;通过m RNA衰减实验检测,揭示METTL3调控PD-L1 m RNA的稳定性;通过q RT-PCR、western blot、流式检测,阐明METTL3调控的PD-L1表达。2.通过RIP-q PCR实验,证实IGF2BP3与PD-L1 m RNA结合关系;在敲低METTL3表达的细胞系中,通过RIP-q PCR检测,再次分析IGF2BP3与PD-L1 m RNA之间的结合关系是否受到METTL3的影响;通过m RNA衰减实验检测,揭示METTL3-IGF2BP3轴共同参与调控PD-L1 m RNA的稳定性;通过q RT-PCR、western blot、流式检测,阐明METTL3-IGF2BP3轴对PD-L1表达的调控作用。3.在敲低METTL3或敲低IGF2BP3的乳腺癌细胞与免疫细胞（cytokine-induced killer cells）共培养的体系中,通过LDH释放实验,检测T细胞杀伤效应;通过ELISA检测上述体系中IL-2、IFN-γ等活化标志物的表达情况,以证实METTL3或IGF2BP3参与T细胞活化过程的调控;通过q RT-PCR检测T细胞耗竭的marker即PD-1、TIM3、NR4A1的表达,揭示METTL3或IGF2BP3参与T细胞耗竭的过程。4.通过构建B-NDG免疫缺陷小鼠的异种皮下移植瘤模型,验证METTL3与IGF2BP3对皮下瘤体生长的影响;利用带Luc标记的鼠源乳腺癌细胞4T1,在BALB/c免疫健全小鼠构建同种腹腔移植瘤模型,通过生物发光检测以及免疫组化实验,证实METTL3对腹腔内瘤体生长的影响以及对微环境中CD3+、CD8+、CD4+的T细胞浸润情况;也在BALB/c小鼠构建同种皮下瘤移植瘤模型,通过生存分析以及免疫组化检测,明确METTL3对皮下瘤体生长、生存的影响以及对微环境中CD3+、CD8+、CD4+的T细胞浸润的调控作用。5.通过包含140例乳腺癌的组织芯片及临床信息,分析PD-L1与METTL3与IGF2BP3的表达相关性;利用在线数据库TISIDB,揭示METTL3与IGF2BP3在接受抗PD-1/PD-L1治疗应答的肿瘤中的表达情况。研究结果:1.在m~6A表观芯片、Me RIP-seq、表达谱数据中分析得到PD-L1可能是METTL3介导的m~6A修饰的直接下游靶点;在敲低METTL3表达的MDA-MB-231、HCC38、SK-BR-3、4T1四种乳腺癌细胞中,RIP-q PCR实验发现METTL3与PD-L1 m RNA是直接结合的,并且通过Me RIP-q PCR检测发现PD-L1 m RNA的m~6A修饰水平能被甲基转移酶METTL3参与调控;为了明确修饰位点信息,通过测序结果与预测分析得到位于PD-L1 m RNA的编码区上有三个高可信度位点后,构建单个位点的突变载体的质粒并转入细胞后,进行荧光素酶报告基因检测,发现突变后的位点与METTL3的结合明显下降;利用绝对定量PCR检测,发现METTL3对三个位点均有修饰效应;通过m RNA衰减实验检测,结果揭示PD-L1 m RNA的稳定性能被METTL3介导的修饰过程所调控;最后通过q RT-PCR、western blot、流式检测,明确了METTL3能促进PD-L1的表达水平。2.通过RIP-q PCR实验,证实IGF2BP3在PD-L1 m RNA上具有高富集现象,证明结合关系;在敲低METTL3表达的细胞系中,通过RIP-q PCR检测,得到IGF2BP3与PD-L1 m RNA之间的结合关系的确受到METTL3表达的影响,证明METTL3-m~6A-IGF2BP3轴对PD-L1的甲基化修饰具有调控效应;通过m RNA衰减实验检测,揭示METTL3-IGF2BP3轴共同参与并促进PD-L1 m RNA的稳定性;通过q RT-PCR、western blot、流式检测,阐明METTL3-IGF2BP3轴共同参与增强PD-L1表达。3.在MDA-MB-231细胞与CIK免疫细胞共培养的体系中,通过LDH释放实验,检测得到敲低METTL3或IGF2BP3后能增强T细胞杀伤效应;通过上述共培养体系,T细胞活化的marker即IL-2、IFN-γ的表达情况被ELISA实验检测分析,以证实敲低METTL3或IGF2BP3可以发挥提高T细胞活化的作用;通过q RT-PCR检测T细胞耗竭的marker即PD-1、TIM3、NR4A1的表达,揭示敲低METTL3或IGF2BP3可以明显降低T细胞耗竭。4.构建B-NDG免疫缺陷小鼠的异种皮下移植瘤模型,结果发现敲低METTL3与IGF2BP3的表达后皮下瘤体生长较对照组更缓慢;利用带Luc标记的鼠源乳腺癌细胞4T1,在BALB/c免疫健全小鼠构建同种腹腔移植瘤模型,通过生物发光检测以及免疫组化实验,证实敲低METTL3可以明显降低腹腔内瘤体的生长以及显著增加肿瘤微环境中CD3+、CD8+、CD4+的T细胞浸润;同样,于BALB/c小鼠构建同种皮下瘤移植瘤模型,发现敲低METTL3后可以降低皮下瘤生长、延长小鼠的整体生存期,以及免疫组化检测得到敲低METTL3可以明显提高肿瘤微环境中CD3+、CD8+、CD4+的T细胞浸润。5.通过分析包含了140例乳腺癌的组织芯片及相对应临床信息的数据之后,结果发现PD-L1与METTL3与IGF2BP3的表达呈现正相关性,并且在预后较差的三阴型以及HER2+的乳腺癌中,正相关性程度较Luminal-A与Luminal-B更高,并且在METTL3表达较高的组织中PD-L1表达也更高,当IGF2BP3表达较低时PD-L1表达也更低,这提示METTL3-IGF2BP3-PD-L1调控关系的存在;利用在线数据库TISIDB,发现METTL3与IGF2BP3在接受抗PD-1/PD-L1治疗应答的患者肿瘤中表达更高,这提示METTL3与IGF2BP3高表达的肿瘤可能会对PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂疗效反应更好。研究结论:1.PD-L1是METTL3介导的m~6A修饰的下游靶点。并且PD-L1 m RNA中CDS区域的三个甲基化位点水平的变化被证实是由METTL3所介导调控其稳定性,进而PD-L1表达水平被提升。2.IGF2BP3作为阅读蛋白,参与METTL3-m~6A-IGF2BP3轴对PD-L1的m~6A甲基化修饰。3.METTL3以及IGF2BP3都能通过提高PD-L1表达进而促进乳腺癌的肿瘤免疫逃逸过程。4.METTL3可以减缓移植瘤模型中瘤体的进展,增加肿瘤微环境免疫细胞的浸润。5.临床组织中PD-L1分别与METTL3和IGF2BP3的表达都呈现正相关性,并且METTL3与IGF2BP3高表达的肿瘤可能会对PD-1/PD-L1抑制剂疗效反应更好。