研究背景急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)发病率高、死亡率也高,对一些重症AKI尚缺乏有效的治疗方法[1]。线粒体是细胞代谢的主要能量来源,也是调节细胞死亡的重要细胞器。细胞损伤或缺氧时,可通过激活Caspase系统或ROS的释放,启动不同类型的细胞死亡[2]。致病因素导致肾小管上皮细胞线粒体功能障碍,进而激活多种细胞死亡通路,可能是AKI发生发展的重要机制。新近研究表明,焦亡是AKI时肾小管上皮细胞死亡的主要方式,但目前对其发生机制及信号通路知之甚少。我们前期研究发现Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(ACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3,Nlrp3)在AKI发病机制中发挥着重要作用,并在肾小管上皮细胞焦亡发生中扮演关键角色,但其上游调控通路及其机制尚不清楚。目前研究显示线粒体功能障碍在Nlrp3激活中起到了中枢作用,而动力相关蛋白-1(dynamin-related protein 1,Drp1)是线粒体分裂的关键“分子开关”,参与了线粒体功能障碍的发生发展[3]。最新研究显示RNA病毒可通过Drp1介导Nlrp3的激活[4]。但是Drp1、线粒体功能障碍和Nlrp3三者之间的相互关系及调控机制尚不明了。基于上述背景,我们提出Drp1通过调控线粒体/Nlrp3轴进而介导AKI中肾小管上皮细胞焦亡的假设。本项目首先验证急性肾损伤中肾上皮细胞的焦亡效应,再通过分别干预Drp1,线粒体/Nlrp3轴,以研究Drp1、线粒体及炎症体分子之间的相互作用及调控机制,为阐释AKI中肾小管上皮细胞焦亡的发生机制,寻找AKI治疗的新靶点提供新思路。研究内容本研究拟采用缺氧复氧(H/R)措施处理人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),以模拟HK-2细胞缺血再灌注损伤,并检测被处理细胞的炎性因子IL-1?以及caspase-1蛋白表达水平及肾小管上皮细胞焦亡情况,探讨缺血再灌注(I/R)后人肾小管上皮细胞炎症及焦亡反应状态,并检测HK-2细胞中Nlrp3炎性体、活性氧ROS、Drp1的表达,探讨I/R导致HK-2细胞炎性因子IL-1?活化及焦亡的可能机制。同时使用Mdivi-1阻断Drp1的活性,再检测H/R的HK-2细胞中Drp1、Nlrp3炎性体表达变化,同时对H/R的HK-2细胞炎性因子IL-1?表达水平、活性氧ROS、肾小管上皮细胞焦亡及焦亡相关分子表达进行检测,研究Drp1在炎症及焦亡反应中的作用及其可能机制。研究步骤1.体外扩增si Nlrp3腺病毒,计算病毒滴度和MOI值,供后续试验。2.体外培养人肾小管上皮细胞,用缺氧复氧条件模拟人肾小管上皮细胞缺血再灌注模型。3.用流式细胞仪观察各组细胞焦亡的情况。4.采用Beckman AU5800全自动生化分析仪对各组细胞上清中乳酸脱氢酶的水平进行检测。5.激光共聚焦观察各组细胞活性氧的表达水平。6.采用Western blot法对Nlrp3、caspase-1、Drp1、IL-1?蛋白在各组细胞中的表达进行检测。实验结果1.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞发生了细胞焦亡。(1)正常对照组:细胞培养上清液中乳酸脱氢酶LDH为36.90±1.89 IU/L,流式细胞仪检测显示,正常对照组细胞焦亡率仅为0.115%。(2)缺氧/复氧(H/R)组:缺氧复氧24h后,细胞上清液中焦亡相关分子乳酸脱氢酶显著升高达58.80±6.58 IU/L,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);人肾小管上皮细胞焦亡率增多至5.27%,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),说明缺氧复氧能显著增加人肾小管上皮细胞的焦亡。2.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞Nlrp3炎性体、IL-1β、caspase-1水平升高,沉默Nlrp3能减少Nlrp3炎性体、IL-1β、caspase-1表达水平,同时降低人肾小管上皮细胞焦亡率。(1)正常对照组:人肾小管上皮细胞中Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平较低。(2)缺氧/复氧(H/R)组:与正常对照组相比,缺氧复氧24h后,人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化增加,炎性因子IL-1β水平显著升高(P<0.05)。(3)缺氧/复氧+Nlrp3沉默腺病毒(H/R+si Nlrp3)组:与缺氧/复氧(H/R)组相比,缺氧复氧24h后,人肾小管上皮细胞焦亡升高程度(1.78%)显著低于缺氧/复氧组(5.27%)(P<0.05),人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化减少,炎性因子IL-1β水平显著降低(P<0.05),表明si Nlrp3腺病毒能有效地减轻缺氧复氧诱导的人肾小管上皮细胞焦亡,Nlrp3参与了缺氧复氧导致的人肾小管上皮细胞焦亡。3.缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞中Drp1、ROS表达上调,Mdivi-1能抑制Drp1活化,减少ROS表达,同时降低Nlrp3、caspase1、炎性因子IL-1β水平,并减少细胞焦亡。(1)正常对照组:人肾小管上皮细胞中Drp1、ROS水平较低。(2)缺氧/复氧(H/R)组:与正常组相比,缺氧复氧24h后,人肾小管上皮细胞Drp1表达显著上调(P<0.05),细胞中活性氧表达也显著升高。(3)缺氧/复氧+Mdivi-1(H/R+Mdivi-1)组:缺氧/复氧(H/R)组,Mdivi-1未能明显降低Drp1表达,但细胞中活性氧的表达显著降低,人肾小管上皮细胞焦亡升高程度(1.8%)显著低于缺氧/复氧组(5.27%)(P<0.05),人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1活化减少,炎性因子IL-1β水平显著降低(P<0.05),提示抑制Drp1活化能有效减低细胞活性氧水平,降低人肾小管上皮细胞Nlrp3、caspase-1表达,Drp1参与了缺氧复氧诱导的人肾小管上皮细胞焦亡。结论1.细胞焦亡是缺氧/复氧诱导肾小管上皮细胞死亡的重要方式。2.缺氧/复氧通过上调Drp1,诱导Nlrp3炎性体表达和线粒体功能障碍,进而导致人肾小管上皮细胞发生炎症反应和焦亡,是急性缺血性肾损伤的重要发生机制。