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目的：
目前流行病学及动物实验均已证实煤焦沥青(CoalTarPitch,CTP)具有致癌性，特别是对肺癌具有高度选择性。在正常细胞中，Keap1-Nr2/ARE通路调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达，保护细胞免受氧化损伤。另有研究显示多功能蛋白p62/SQSTM1(Sequestosome1)可能参与Keap1-Nrf2/ARE通路的调节，因此p62-Keap1-Nrf2/ARE通路在抗肿瘤方面可能具有重要作用。该研究主要利用体外细胞实验，应用RNA干扰（RNAInterfering，RNAi）技术沉默人支气管上皮细胞(HumanBronchialEpithelialCells，BEAS-2B)中Nr2基因的表达，建立Nrf2基因沉默的BEAS-2B细胞稳定表达株，随后建立CTP烟提取物诱导的BEAS-2B细胞恶性转化模型，在确定细胞发生恶性转化的基础上，动态观察不同代次细胞Keap1-Nrf2/ARE通路中相关基因及蛋白的改变，探讨CTP烟提取物致细胞发生恶性改变过程中p62-Keap1-Nrf2/ARE通路的作用机制，为寻找可能发生癌变的关键阶段及揭示肺癌发生机制提供线索。
方法：
1.采用G418测定BEAS-2B细胞对其最低耐受浓度;小干扰RNA(SmallInterferingRNA，siRNA)通过RNAi-Mate转染，从4条siRNA序列中筛选出1条沉默Nrf2基因的最佳序列，荧光显微镜观察及RT-PCR验证其结果;细胞转染si-Nrf2重组质粒过程中将细胞分为目的基因实验(siRNA)组、空白对照组、G418对照组、转染试剂对照(mock)组，RNAi技术沉默BEAS-2B细胞中Nrf2基因的表达，G418抗性筛选BEAS-2B细胞Nrf2基因沉默稳定表达株，RT-PCR检测各组细胞中Nrf2mRNA的表达量。
2.以BEAS-2B细胞为靶细胞，设立二甲基亚砜（DimethylSulfoxide，DMSO）阴性对照组、苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene，B(a)P)阳性对照组、煤焦沥青烟提取物染毒(CTP)组、RNAi组，建立细胞恶性转化模型，软琼脂集落形成实验分析细胞恶变情况，采用RT-PCR、Westernblot技术分别检测10代、20代、30代细胞p62、Keap1、Nrf2、NQO1基因和蛋白的表达情况。
结果：
1.BEAS-2B细胞RNAi处理
G418最佳筛选浓度为400μg/ml;沉默Nrf2最佳的siRNA序列为Nrf2-homo-001;G418筛选细胞转染si-Nrf2重组质粒实验中siRNA组Nrf2mRNA相对表达量显著低于空白对照组、G418对照组和mock组，差异均有统计学意义（均P＜0.001），空白对照组与G418组、mock组比较，差异均无统计学意义(P=0.801;P=0.184)，G418组与mock组比较，差异无统计学意义(P=0.125)。
2.软琼脂克隆形成
各组细胞10代时克隆数30个以内;20代时RNAi组克隆形成率显著高于CTP组和B(a)P组，差异均有统计学意义（均P＜0.001）;B(a)P组克隆形成率与CTP组比较，差异无统计学意义(P=0.066);30代时，RNAi组克隆形成率显著高于CTP组和B(a)P组，差异均有统计学意义（均P＜0.001），而CTP组克隆形成率高于B(a)P组，差异有统计学意义(P＜0.001)。
3.p62、Keap1、Nrf2、NQO1基因和蛋白的表达情况
CTP烟提取物作用于BEAS-2B细胞后，随传代次数增加，B(a)p组、CTP组和RNAi组p62的mRNA和蛋白水平上调;Keap1蛋白表达下调;B(a)p组和CTP组Nrf2的mRNA水平变化不显著，但两组的Nrf2蛋白水平上调，RNAi组Nrf2的mRNA和蛋白水平一直处于较低水平;B(a)P组、CTP组和RNAi组抗氧化基因NQO1的mRNA和蛋白水平均上调，但RNAi组的表达量显著低于B(a)P组和CTP组，差异均有统计学意义（均P＜0.001）。
结论：
CTP烟提取物作用于BEAS-2B细胞，随传代次数增加，细胞发生恶变;CTP烟提取物刺激BEAS-2B细胞，激活了Keap1-Nrf2/ARE信号通路;抑制Nrf2基因的表达能够促进CTP烟提取物诱导BEAS-2B细胞发生恶变;p62可能参与Keap1-Nrf2/ARE信号通路的调节，同时还存在其他通路参与NQO1的调控。综上，p62-Keap1-Nrf2/ARE通路可能通过上调NQO1的表达对抗CTP烟提取物毒性作用，降低细胞氧化损伤，延缓细胞恶变。