[研究背景]胶质瘤,尤其是胶质母细胞瘤,由于其恶性程度高,生长快,病程短,且对放化疗敏感性差,术后复发快,5年生存率仅为20%左右,因此一直被认为是神经外科治疗中最棘手的难治性肿瘤之一。由于肿瘤细胞具有的高度异质性,基因遗传学上的多样化,我们在认识胶质瘤的起源,细胞调节机制以及生长特性上遇到了很多困难。肿瘤干细胞假说认为在肿瘤细胞中仅有一小部分(1%)的细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化潜能的干细胞样特性,它们是肿瘤发生,转移和复发的根源。而肿瘤中的绝大部分细胞不具有上述特性,无法独立在体内形成种植性肿瘤。Bonnet等最早在急性髓性白血病中分离出白血病干细胞,而脑肿瘤的干细胞研究始于Ignatova,紧接着Singh,Galli等先后通过体内外实验在人的髓母细胞瘤,不同级别的胶质瘤中发现了肿瘤干细胞,他们认为只有这些细胞具有导致肿瘤形成的能力。上述的研究为我们研究胶质瘤提供了一个新的思路,为今后的靶向治疗奠定了基础。常用的鉴定脑肿瘤干细胞的方法主要有三种,即悬浮克隆球形成法,CD133免疫磁珠分选法和SP流式细胞仪筛选法。由于标本来源不同,方法不同使得脑肿瘤干细胞在比例构成、生物学特性等方面还存在很大的争议。Kondo以及国内的学者通过SP细胞流式筛选法和悬浮克隆球法在大鼠胶质瘤C6细胞系中发现了小部分(0.4%、1%)具有肿瘤干细胞样特性的细胞,国内的黄强等利用CD133免疫磁珠分选法也在体外长期培养的SHG—44胶质瘤细胞系中发现了肿瘤干细胞的存在。但是也有作者发现在体外长期培养的细胞系中不存在肿瘤干细胞,它们的基因与母代细胞发生了根本变化,因此不具有体内致瘤性。我们的初步观察发现大鼠胶质瘤C6细胞系生长极其旺盛与人原代胶质瘤细胞相比在克隆球形成能力以及致瘤能力等很多方面存在着差异,因此对两种细胞从脑肿瘤干细胞的概念和细胞生物学特性出发,作了进一步系统的肿瘤干细胞的研究。[目的]明确人胶质母细胞瘤以及体外长期培养的大鼠胶质瘤C6细胞系中的肿瘤干细胞及其特性;利用三种不同的分类方法获得肿瘤干细胞并比较它们在构成以及生物学特性上的差异,从而获得最理想的鉴定、分离方式;明确原代肿瘤干细胞和体外长期培养的细胞系中的肿瘤干细胞的异同,进一步阐明肿瘤干细胞在肿瘤发生,发展中的作用。[方法]第一部分:通过无血清培养基条件观察5例人原代胶质母细胞瘤细胞中悬浮克隆球的形成以及在含血清和无血清两种培养基中的生长转化情况;利用流式细胞仪比较原代肿瘤细胞与克隆球细胞中CD133阳性细胞的构成;利用单细胞克隆培养技术获得具有自我更新能力的细胞比例;利用细胞免疫荧光技术检测细胞的多向分化能力以及抗原的共表达情况;通过裸鼠致瘤实验验证人原代胶质母细胞瘤细胞中具有连续克隆形成能力的细胞的体内致瘤能力。第二部分:通过血清和无血清培养基的相互转化,观察大鼠胶质瘤C6细胞系在两种培养基中的生长特性变化;利用流式细胞仪比较在不同培养条件下CD133阳性细胞以及分化细胞的构成变化;利用无血清条件下连续单细胞克隆培养初步获得具有自我更新能力的细胞比例;利用细胞免疫荧光和免疫组织化学技术检测多向分化能力以及抗原的共表达情况;通过裸鼠致瘤实验验证C6单细胞以及种植瘤细胞的肿瘤发生能力。第三部分:通过CD133免疫磁珠分选技术将原代人胶质瘤细胞和大鼠C6细胞分为CD133阴性和阳性组;利用western blot技术和免疫荧光技术检测细胞纯度;利用Brdu染色检测细胞的增殖能力,利用克隆形成试验、免疫荧光技术、体内致瘤实验检测不同细胞组间肿瘤干细胞样细胞的构成以及生物学特性;利用western blot和细胞免疫组织化学技术监测分选细胞CD133表达变化情况;利用荧光显微镜观察Hoechst33342对细胞的毒性作用和ABCG2蛋白的表达。[结果]一、人脑胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的分离、鉴定1.5例人胶质母细胞瘤中有5.8-13.9%的细胞具有克隆形成能力,悬浮克隆球细胞中有20—34.5%左右的细胞具有再次形成克隆球的能力,同时这些细胞具有多向分化为表达GFAP/NSE阳性细胞的能力和体内致瘤的能力。2.人胶质母细胞瘤克隆球细胞可以连续在血清和无血清条件下相互转化,同时发现有少量细胞会出现CD133与GFAP/NSE的共表达现象。3.流式细胞仪和免疫组织化学结果显示克隆球中CD133阳性细胞比例要明显高于原代人胶质母细胞瘤实体细胞中CD133阳性细胞比例。4.裸鼠致瘤实验发现人胶质母细胞瘤中只有克隆球形成能力的细胞具有致瘤能力;种植瘤中的子代细胞同样有母代肿瘤干细胞样细胞的存在。二、大鼠C6胶质瘤细胞系肿瘤干细胞的分离、鉴定5.C6细胞在血清和无血清条件下可以相互转化生长,血清培养条件不影响细胞在无血清培养基中的克隆球形成能力。6.C6胶质瘤细胞系中有＞60%的细胞及其子代细胞可以在无血清培养基中形成克隆球,有＞90%的细胞及其子代细胞可以在含血清培养基中无限扩增。同时这些细胞具有胶质瘤样细胞,神经元样细胞的多向分化能力以及体内致瘤能力。7.流式细胞仪和免疫组织化学结果显示长期血清培养基条件下C6细胞中约有30%的细胞为CD133阳性表达。在无血清培养条件下克隆球中的比例＞85%。8.C6细胞在含血清培养基中有CD133与GFAP/NSE的共表达现象,而在克隆球中该现象明显减少。9.裸鼠致瘤实验发现所有参与种植的C6单细胞克隆株均可成瘤,且种植瘤子代细胞同样具有肿瘤干细胞样特性,与母代细胞一致。三、不同方法鉴定胶质瘤肿瘤干细胞的比较分析10.大鼠胶质瘤C6细胞系中CD133阴性和阳性细胞均有肿瘤干细胞样细胞存在,两者在细胞增殖、克隆形成方式,致瘤速度等方面存在一定差异。11.人胶质母细胞瘤细胞中CD133阴性细胞不具有肿瘤干细胞样特性,也并不是所有的CD133阳性细胞具有克隆形成能力。12.在长期血清培养条件下,C6细胞中CD133阴性的细胞可以产生阳性细胞,而人胶质母细胞瘤细胞中未发现该现象。13.Hoechst33342对大鼠C6细胞和人胶质母细胞瘤细胞均有毒性作用。14.C6细胞系和人胶质母细胞瘤细胞中均发现有1%左右的细胞ABCG2蛋白表达阳性。而且仅该部分细胞在与Hoechst33342共同孵育后仍保留有肿瘤干细胞样特性,而其它细胞均丧失了自我更新能力。[结论]1.人胶质母细胞瘤和体外长期血清培养的大鼠胶质瘤C6细胞系中均有肿瘤干细胞样细胞的存在。2.人胶质母细胞瘤和C6细胞系中的肿瘤干细胞样细胞在比例构成,自我更新能力、干细胞与分化抗原共表达、在血清与无血清两种条件下相互转化能力以及体内致瘤能力上均存在着较大的差异。3.C6细胞系中同时存在CD133阴性以及CD133阳性的肿瘤干细胞样细胞,同时CD133阴性和阳性细胞可以相互转化。而在人胶质母细胞瘤中仅有CD133阳性细胞表现有自我更新、多向分化和连续致瘤的能力。4.Hochest33342对人胶质母细胞瘤细胞和C6细胞均有毒性作用,会将那些缺乏ABC转运蛋白(如ABCG2蛋白)表达而没有能力把Hochest33342崩出体外但具有肿瘤干细胞特性的细胞排除在SP细胞范围之外。5.利用肿瘤干细胞生物学特性分离、鉴定法获得的悬浮克隆球数与CD133免疫磁珠分选以及SP细胞的比例存在一定差异,因此寻找一种新的更能全面反映脑肿瘤干细胞的分子标记是今后研究的重点。