紫锥菊中两类活性成分的纯化及其神经炎症小鼠的保护作用研究

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神经炎症是指胶质细胞的异常活化,并伴随着炎症因子的产生;在生物体内未能及时代谢并聚集在中枢神经系统微环境中,引起神经炎症级联反应,进而加速了中枢神经系统退化的进程。小胶质和星形胶质细胞的激活与帕金森(PD)炎症发病、进展关系密切。除了人工合成的神经炎症抑制剂,天然植物中也具有许多抗炎作用的活性成分;紫锥菊咖啡酸衍生物(CADs)、烷基酰胺(AADs)具有抗炎、增强免疫活性。我们推测其可能具有潜在的抑制脑部神经炎症作用,在此基础上研究紫锥菊活性成分对PD小鼠的保护作用。主要结论如下:(1)探究了紫锥菊中CADs与AADs成分的同步提取工艺。建立了定性定量检测紫锥菊活性成分的高效液相色谱方法(HPLC),定性检测紫锥菊中CADs主要含有单咖啡酰酒石酸、菊苣酸;AADs主要含有十二碳-2E,4E,8Z,10E/Z-四烯酸异丁基酰胺(DTAI)。方法学验证实验:精密度、重现性RSD<1%,各成分回收率94.88~100.07%,表明该方法准确可靠。并优化了CADs和AADs同步提取工艺:醇/水浓度70%、料液比1:25、70℃提取75 min;此条件下紫锥菊一次粗提液中CADs提取含量(五种成分之和)为2.31±0.18 mg/g,以DATI计算的AADs含量为0.142±0.02 mg/g。(2)研究了CADs和AADs的分离纯化方法,主要得到五种CADs成分及三种AADs成分的纯化物。紫锥菊浸膏经石油醚萃取分离,其中萃取物含以DTAI为主的AADs粗品;萃余物含以单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、菊苣酸为主的CADs粗品;它们均可作为进一步纯化原料。通过D101大孔树脂纯化CADs:上样量75 m L、静态吸附6 h,以水、30%乙醇/水依次洗脱过柱,可获得HPLC纯度达95.3%的菊苣酸;合并剩余成分可得CADs总含量为43.85±0.65 mg/g的纯化物。液相色谱-质谱联用(LC-MS)鉴定纯化物成分,CADs纯化物主要为单咖啡酰酒石酸、绿原酸、咖啡酸、松果菊苷和菊苣酸。采用硅胶柱层析、葡聚糖凝胶LH-20纯化AADs粗产物,获得三种保留时间分别为6.99 min、10.25 min和15.2 min的物质。定性检测确定15.2 min的物质为DTAI,LC-MS和核磁共振波谱再次确定该物质为DTAI,其10位碳原子E/Z构型比例约为3.2:1;此外,6.99 min、10.25 min的物质经LC-MS鉴定为十一碳-2Z,4E-二烯-8,10-二炔酸异丁基酰胺和十二碳-2Z,4E,10Z-三烯-8-炔酸异丁基酰胺。合并剩余物质,DTAI含量由萃取物中0.524±0.04 mg/g提高至5.30±0.25 mg/g。(3)研究了CADs、AADs纯化物单用及联合给药对PD小鼠的保护作用。通过对PD小鼠的行为学、炎症因子、神经元细胞及胶质细胞阳性率、多巴胺及其代谢物含量进行研究。结果显示,CADs与AADs成分在高剂量联用时对降低炎症因子i NOS、COX-2、TNF-α、IL-6水平具有累加效果;免疫组化检测纹状体内阳性细胞率,结果显示混合高剂量、CADs高剂量、AADs高剂量组分别比模型组提高了95.0%、94.8%、94.0%;免疫荧光检测胶质细胞阳性率,存在剂量依赖性,以CADs和AADs成分在高剂量联用时对降低IBA-1和GFAP阳性细胞率有累加效应;HPLC测定纹状体内多巴胺及其代谢产物含量,结果显示CADs、AADs两类高剂量活性成分对多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸、高香草酸的含量均有明显恢复作用。综上所述,混合高剂量对帕金森炎症小鼠的保护作用优于CADs高剂量、AADs高剂量,表明两类成分联用具有累加效应。
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