研究背景：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)是介于细菌与病毒之间的一类无细胞壁的原核细胞型生物。能在体外生存而不依靠活细胞,能够自我复制。主要通过呼吸道传播,儿童和青年人易感,一般为散发或小流行,一年四季均可发病,多在秋季暴发,流行趋势为每3-7年在全球流行,在人群密集处如学校发病率高,在家庭成员中易相互传染。从近年来流行的报道可以看出MP肺炎发病率有上升趋势,占各类肺炎总数的8.5%-27.9%,而且在小年龄儿童呼吸道感染中也较常见,MP对人类健康的威胁已不容忽视。重症肺炎支原体肺炎表现为大量胸腔积液、急性呼吸窘迫综合征(ARDS).肺纤维化、阻塞性细支气管炎等,而且常常伴随肺外表现,如脑炎、心肌炎、肝炎、肾炎等,严重威胁儿童的身心健康,甚至危及生命。早期诊断和治疗显得非常重要。MP缺乏细胞壁这一结构特点,使其对影响细胞壁合成的抗生素具有本质耐药性。临床治疗MP感染主要选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物,如大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类。由于儿童处于生长发育期,能够用于治疗儿童MP感染的药物选择更少,目前首选大环内酯类药物,主要为14元环的红霉素和15元环的阿奇霉素。而四环素类、氨基糖苷类和喹诺酮类由于副作用的原因,已极少用于儿科临床。随着大环内酯类抗生素的广泛使用,已有越来越多关于MP对大环内酯类抗生素耐药的报道。我们在临床上也常发现大环内酯类药物治疗无效的病例,这些病例经大环内酯类抗生素治疗后,体温不降,咳嗽和肺部炎症无好转,易合并胸腔积液和肺不张,需要调整药物治疗。细菌药物研究较早,有了很多发现。但由于MP生长缓慢、培养周期长和需要特殊培养基,体外分离培养比较困难,以往MP感染的诊断多依赖血清学检查,因此药物敏感性研究报道较少。PCR技术是20世纪分子生物学的重大发现,可以迅速获取大量的单一核酸片段,使人们能通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍,具有操作简便易行、检测周期短和灵敏度高等优点,所以近年来该方法得到了发展。目前国内外的报道认为MP对大环内酯类抗生素的耐药与结合位点的基因突变密切相关,其中以23S rRNA基因的2063(相当于大肠杆菌2058)、2064(相当于大肠杆菌2059)位点变异报道较多。Matsuoka M[2]等报道在日本分离76株耐药MP中分离出13株对红霉素耐药,其中12株高度耐药,10株在2063位发生A到G突变,1株在2064位发生A到G突变,对红霉素低耐药株在2617位发生C到G突变；在体外分离的MP红霉素耐药株中,1株出现2617位C到G的点突变,1株出现2064位A到C点突变、2617位C到A点突变。国内Xin D等报道[3],46株大环内酯类抗生素耐药的耐药机制与2063、2064位点突变有关。然而,目前为止,国内尚未有关2617位点突变情况的研究报道。本课题利用多聚酶链反应对肺炎支原体含有2617位点的DNA片段进行扩增并测序,将其与MP标准敏感株M129核苷酸序列进行比较。并对MP肺炎患儿的临床资料进行统计分析,分析2617位点突变情况及与大环内酯类抗生素耐药性的相关性。目的：研究临床分离的MP23S rRNA基因2617位点突变情况。了解该位点突变与MP肺炎大环内酯类抗生素耐药性的相关性。方法：本研究以2009年4月～2010年4月浙江大学医学院附属儿童医院呼吸科因MP肺炎住院235例患儿的鼻咽吸出物(NPA)作为研究对象,对其进行MP23SrRNA基因检测并测序,并对临床资料进行分析。1、收集患儿的NPA：所有235例患儿均于入院当天采集NPA,密封送检,标本立即用于测试或保存于-20℃待测,保存期不超过一周,提取MPDNA,进行荧光定量PCR。选取经PCR荧光探针法测定浓度1.0x104以上(包括1.0x104)NPA作为下一步实验标本,12000转/分钟,5分钟离心后取上清于1.5ml离心管中放入-80℃冰箱中冻存备用。2、应用PCR扩增：从美国国立生物信息中心(NCBI)检索MP23S rRNA基因序列,根据国外研究报道的突变热点区即23S rRNA的2617位两侧自行设计PCR引物,对扩增的产物进行电泳检测,用以检测是否存在目的片段。3、MP23S rRNA基因测序：经电泳检测阳性的标本经乙醇纯化后作双脱氧末端终止法全自动DNA测序,测得序列与NCBI已登录的MP标准株(M129)23S rRNA基因作比对,每次试验设立阳性和阴性对照。4、临床资料比较：采集并比较MP23S rRNA基因发生突变组和未发生突变组的MP肺炎的性别、年龄、临床表现、并发症、实验室检查结果、胸部X线的特点及治疗情况等。5、统计学处理：采用SPSS16.0统计软件进行分析,计量资料x±s表示,两组比较采用t检验,多组采用方差分析,继以LSD两两比较。计数资料比较采用χ2检验,以P<0.05表示为差异有统计学意义。结果：1、本地区分离MP株与MP标准株(M129)23S rRNA基因2617位点前后245bp序列一致。2、235例MP标本中,未发现23S rRNA基因2617位点突变。结论：本地区分离MP株与MP标准株(M129)23S rRNA基因具有很好的同源性,23SrRNA2617位点突变在本地区肺炎支原体耐药中占非主导地位。