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白簕Acanthopanax trifoliatus(Linn.)Merr.为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)攀援状灌木,具有清热解毒、祛风除湿、消瘀止痛、补中益气等功效。在课题组前期研究中,通过水提醇沉法从白簕茎中制备粗多糖ATP(Acanthopanax trifoliatus polysaccharide),经DEAE-52纤维素柱层析分离得到中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3。ATP1经过反复Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析获得分子量均一的中性多糖ATP1-1,药理实验证实ATP1-1可使链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠血糖值降低,其降糖机制与调节肝糖代谢相关。本论文在前期研究的基础上,对白簕多糖的脱色工艺进行系统的考察,对ATP1-1的降糖机制进行深入探索,证实了其与细胞凋亡的关系。同时对酸性多糖ATP2和ATP3进行分离、纯化,获得均一分子量的多糖组分,采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析其单糖组成。研究内容对分析白簕多糖的化学结构、阐明白簕多糖的降糖机制提供了理论基础,为充分利用白簕植物资源提供了科学依据。主要研究内容和结果如下:1、鉴于白簕多糖的色素含量较高,给多糖结构的分析鉴定造成干扰,因此对白簕多糖的脱色工艺进行系统考察。采用大孔树脂静态吸附法进行脱色工艺研究,对比NKA-9、S-8、HPD450、AB8、D101和HPD600这6种树脂的脱色效果。通过单因素试验考察多糖浓度、树脂用量、振摇速度、振摇时间对脱色效果的影响,进而采用正交设计筛选最佳脱色工艺参数。结果表明S-8和HPD450两种树脂脱色效果较好,最佳工艺均为:30 mL浓度为15 mg/mL的白簕多糖溶液与5g树脂混合均匀,以85 r/min的速度振摇8 h。在上述工艺条件下,S-8的脱色率和多糖保留率分别为:88.89%和61.86%;HPD450的脱色率和多糖保留率分别为:87.20%和64.62%。进一步考察了两种树脂混合后的脱色效果,结果表明S-8与HPD450树脂混合脱色效果优于单一树脂,按S-8:HPD450=1:4比例进行混合时,协同作用更佳,脱色率为89.78%,多糖保留率为69.35%。2、采用连续5天多次小剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法,建立糖尿病小鼠模型。每周剪尾取血测血糖,每天检测小鼠体重和饮食饮水量。结果表明ATP1-1能提高糖尿病小鼠体重,降低饮食饮水量,降低血糖并改善糖耐量。采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)研究胰腺组织结构的变化,并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)和蛋白质印迹(Western Blotting)技术对胰腺凋亡相关因子进行检测,进一步阐明ATP1-1降糖作用机制。结果表明ATP1-1能改善糖尿病小鼠胰岛细胞凋亡,修复胰岛,同时可降低死亡受体途径上的自杀相关因子(factor associated suicide,Fas)及其受体FasL mRNA和蛋白的表达,通过抑制Fas/FasL的相互作用,减少细胞毒性,达到抑制凋亡级联反应来减少胰岛B细胞死亡的作用,从而保护胰岛细胞,促进胰岛素的分泌。同时,研究发现ATP1-1对线粒体途径的B细胞淋巴瘤2家族(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)蛋白有调节作用,能提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白Bax的表达,从而提高Bcl-2/Bax比值。通过维持Bcl-2和Bax的动态平衡,减少炎症反应和氧化应激来抑制细胞凋亡,减缓胰岛素抵抗,减轻糖尿病。Western Blotting技术结果与qPCR结果相符合,表明ATP1-1可能是通过调节Fas/FasL和Bcl-2/Bax来保护胰岛B细胞,起到降低血糖作用。3、采用葡聚糖凝胶Sephadex G-75对白簕酸性多糖ATP2和ATP3进行分离纯化,得到组分ATP2-1和ATP3-1。紫外光谱扫描确认两种多糖不含蛋白质和核酸。高效渗透凝胶色谱法测得ATP2-1的数均分子量Mn为4370(Da),重均分子量Mw为8990(Da),分布宽(D)为2.06。ATP3-1的数均分子量Mn为68700(Da),重均分子量Mw为75200(Da),分布宽(D)为1.09。采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法对酸性多糖ATP2-1和ATP3-1进行单糖组成分析。实验结果表明ATP2-1由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和少量D-半乳糖醛酸组成,摩尔比为1.0:1.2:5.8:7.3:2.8。ATP3-1由L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和少量D-葡萄糖、D-甘露糖组成,摩尔比为1.0:4.1:2.6:2.9。此外对多糖的水解时间,衍生化时间和温度进行工艺优化,确定了最佳反应条件为:多糖水解时间为6 h,衍生化时间为40 min,衍生化温度为60℃。高碘酸氧化结果表明ATP3-1含有1-6位键合的糖基或非还原性末端糖基和少量1→2或1→2,6或1→4或1→4,6键型。