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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC,以下简称肝癌)在全球恶性肿瘤发病率中占第6位,恶性肿瘤死因中占第3位。在中国恶性肿瘤死因中肝癌占第2位。肝癌复发转移是目前肝癌治疗失败的主要原因。目前,手术切除仍然是肝癌治疗的最有效方法。但是肝癌根治性切除术后5年复发转移率高达61.5%,即使小肝癌也达43.5%。肝癌复发转移是多基因,多因素参与的复杂过程,其中一个重要原因就是肿瘤细胞的失巢凋亡抵抗特性,即肿瘤细胞在脱离细胞外基质后仍可以存活并生长,而正常细胞在脱离与细胞外基质的接触后会发生Anoikis凋亡(即失巢凋亡)。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种分泌型糖蛋白,能促进细胞趋化,粘附和迁移。以往的研究发现OPN与肝癌侵袭转移相关。但是,OPN在肝癌细胞抗失巢凋亡中的作用及其分子机制尚未阐明。解析OPN及其信号传导机制对于明确细胞失巢凋亡与肿瘤转移之间的关系有着重要的意义,并将为肝癌及其他许多恶性肿瘤的治疗提供一种有效的方法和途径,在未来的临床应用中将具有广阔的前景。第一部分人肝癌组织中骨桥蛋白及其相关信号分子与肝癌转移特性的关系目的：研究骨桥蛋白(OPN)及其受体和相关信号分子integrinαV, CD44v6, P-FAK, FAK, P-Src, Src, P-ERK, P-AKT在肝癌及癌周组织中的表达,并分析它们与肝癌细胞转移潜能之间的相关性。方法：利用组织芯片,检测89例肝癌组织中OPN及其受体integrinαV, CD44v6和相关信号分子P-FAK, FAK, P-Src, Src, P-ERK和P-AKT表达情况,并分析它们与一系列临床指标之间的相关性。结果：在肝癌组织中：1)OPN表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小和个数、AFP水平、乙肝病毒感染、肿瘤细胞分化、肝硬化程度等指标间无明显相关性,而与肿瘤的TNM分期、有无包膜、门脉癌栓形成等特性间存在显著的相关性(P<0.05)；2) CD44v6的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小和个数、AFP水平、乙肝病毒感染、肿瘤细胞分化、肝硬化程度、肿瘤包膜之间均无明显相关性,而与肿瘤的TNM分期、门脉癌栓形成明显相关(P<0.05); 3) P-Src表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小和个数、AFP水平、乙肝病毒感染、肿瘤TNM分期、门脉癌栓、肝硬化程度、肿瘤包膜间均无明显相关性,而与肿瘤细胞分化明显相关(P<0.05)；4)Src表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小和个数、AFP水平、肿瘤细胞分化、乙肝病毒感染、肿瘤TNM分期、肝硬化程度、肿瘤包膜等均无明显相关性,而与门脉癌栓形成明显相关(P<0.05); 5) P-ERK与患者的性别、年龄、肿瘤大小和个数、AFP水平、肿瘤细胞分化、乙肝病毒感染、肿瘤TNM分期、肝硬化程度、肿瘤包膜等均无明显相关性,而与门脉癌栓形成明显相关(P<0.05); 6)IntegrinαV和P-FAK的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小和个数、AFP水平、肿瘤细胞分化、乙肝病毒感染、肿瘤TNM分期、门脉癌栓形成,肝硬化程度、肿瘤有无包膜等均无明显相关性。7)P-AKT表达与患者的性别,年龄,肿瘤大小和个数,AFP水平,肿瘤细胞分化,乙肝病毒感染,肝硬化程度,有无门脉癌栓均无明显相关性,而与肿瘤TNM分期,肿瘤包膜是否完整明显相关。结论：肝癌组织中OPN的表达以及其受体integrinαV和CD44v6,其下游相关信号磷酸化Src,磷酸化FAK,磷酸化ERK,磷酸化AKT和肝癌的侵袭特性有密切关系,这些信号分子的过表达或活性的提高是肝癌转移的重要原因。第二部分骨桥蛋白表达与下游分子的相关性研究目的：研究OPN与IntegrinαV、CD44v6、磷酸化FAK (P-FAK),磷酸化Src (P-Src)、磷酸化ERK(P-ERK)、磷酸化AKT (P-AKT)的相关程度,以明确在肝癌组织中存在的OPN相关的信号网络。方法：用免疫组织化学染色方法,利用组织芯片检测并分析OPN及其相关分子、Integrin a V, CD44v6、P-FAK、P-Src、P-ERK, P-AKT表达的关系。用Pearson Correlation分析各个分子间的相关系数。结果：OPN与IntegrinαV(p<0.01)、P-ERK (p<0.01), CD44V6(p<0.01)密切相关。虽然OPN与P-FAK、P-Src. P-AKT无显著相关,但他们与OPN的受体IntegrinαV (P<0.01)、CD44V6 (P<0.01)密切相关。结果说明,OPN在肝癌组织中,与上述相关分子组成了与肝癌转移密切关系的信号网络。结论：OPN通过其受体IntegrinαV、CD44V6激活下游的ERK和PI(3)K/AKT途径促进肝癌的转移。第三部分OPN在肝癌细胞耐失巢凋亡中的作用目的：骨桥蛋白(osteopontin OPN)与肝癌的转移有密切关系,但其作用机制还不十分清楚。癌细胞耐受失巢凋亡是癌细胞获得转移能力的首要条件。为此,我们探讨了OPN在肝癌高转移细胞系MHCC97-H耐受失巢凋亡中的作用,以进一步明确OPN促进肝癌转移的机制。方法：MHCC-97H在悬浮培养条件下,观察其对是失巢凋亡的敏感性。经体外化学合成骨桥蛋白序列特异性的RNAi分子(RNAil、RNAi2、RNAi3),用脂质体(Lipofectamine)转染MHCC97-H肝癌细胞系,用Western blot法检测其抑制OPN的表达的作用以及诱导失巢凋亡的作用。用流式细胞仪检测失巢凋亡情况(Annexin V/PI双染色法)。同时,检测OPN下游信号磷酸化FAK(tyr397),磷酸化Src(tyr416)、磷酸化ERK(thr202/tyr204)的变化。结果：在悬浮培养条件下,MHCC-97H耐受失巢凋亡。特异性的OPN RNAi转染后的MHCC-97H细胞后,OPN蛋白表达被显著抑制。实验表明,与空白对照组及相比,特异性RNAi转染组细胞悬浮培养72小时后,凋亡率明显增加(P<0.05)。与此同时,特异性RNAi转染组FAK及其下游信号Src、ERK的磷酸化水平被显著抑制。结论：OPN介导耐受失巢凋亡是高转移潜能肝癌细胞发生转移的机制之一。OPN通过FAK磷酸化,激活FAK/SRC-ERK途径,使高转移潜能肝癌细胞的抵抗失巢凋亡。