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随着我国人口老龄化程度日趋严重,骨质疏松症已成为我国面临的重要公共健康问题。目前临床常用的治疗骨质疏松症药物多为抗骨吸收药物,促骨形成药物较少。因此,进一步深入开展骨质疏松症发生机制的基础研究,以寻求更多有效的促骨形成药物,具有非常重要的临床诊疗价值。细胞周期素依赖激酶2相关性Culin结构域1(CDK2-associated cullin1,CACUL1)是一个与细胞周期调控密切相关的基因,最近研究发现CACUL1通过抑制成脂标志物PPARγ,从而抑制3T3-L1细胞向脂肪细胞转化。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)同3T3-L1细胞一样,都是脂肪细胞的前体细胞,都具有成脂分化的能力。如果CACUL1在BMSCs中也具有相同的抑制成脂分化能力,那么CACUL1即可促进BMSCs向成骨细胞分化,从而发挥抗骨质疏松症的作用。因此,本课题从以下三部分内容进行研究:(1)利用GEO数据库的基因芯片数据,分析CACUL1基因在骨质疏松症患者和正常人BMSCs内表达上的差异;通过临床收集骨质疏松性骨折患者和正常骨折患者的骨髓组织,验证CACUL1基因在骨质疏松患者BMSCs中表达降低;(2)通过培养大鼠BMSCs,分析成脂、成骨分化过程中CACUL1的表达变化趋势;构建腺病毒过表达及沉默CACUL1载体,研究CACUL1对BMSCs成脂、成骨分化的影响;(3)分析CACUL1在BMSCs成骨分化过程中的作用及分子机制。第一部分CACUL1在骨质疏松患者BMSCs中的表达研究目的:通过生物信息学分析CACUL1在骨质疏松症患者和正常人BMSCs中表达差异,明确CACUL1在骨质疏松患者BMSCs中表达降低;通过临床收集骨质疏松性骨折患者和正常骨折患者的骨髓组织,验证CACUL1基因在骨质疏松患者BMSCs中表达降低。方法:GEO数据库检索并下载基因芯片GSE35958的原始数据,使用基于R语言的Bioconductor软件对数据进行预处理及分析,明确CACUL1在骨质疏松患者BMSCs中表达降低。根据纳入排除标准招募骨质疏松性骨折和正常骨折患者各6人;在骨折复位手术中采集扩孔器上残余的骨髓组织,分离培养BMSCs,使用Western blotting实验检测CACUL1蛋白的表达,验证CACUL1基因在骨质疏松患者BMSCs中表达降低。结果:对基因芯片GSE35958的数据进行分析后,共筛选出差异表达基因805个,CACUL1在骨质疏松症患者BMSCs中表达较对照组降低3.5倍。Western Blotting结果显示,骨质疏松症患者BMSCs中CACUL1的表达较正常对照组低。结论:CACUL1在骨质疏松症患者BMSCs中的表达较正常人降低,CACUL1可能在骨质疏松症的发生、发展中发挥重要作用。第二部分CACUL1对BMSCs成脂、成骨分化的作用研究目的:研究CACUL1基因在大鼠BMSCs成脂和成骨分化早期阶段的表达趋势;利用腺病毒沉默或过表达CACUL1,研究CACUL1对BMSCs成脂和成骨分化的作用。方法:使用经典的成脂和成骨诱导方案分别诱导SD大鼠BMSCs,诱导后1d、2d、3d、4d和5d时qRT-PCR和Western blotting方法检测CACUL1的表达。通过腺病毒载体分别沉默和过表达CACUL1基因,检测成脂分化的标志物PPARγ2、LPL和FABP4以及成骨分化的标志物RUNX2、OCN和OPN,明确CACUL1基因对BMSCs成脂和成骨分化的作用。结果:CACUL1 mRNA和蛋白表达在成脂诱导分化后5d下降,而在成骨诱导分化后5d显著增加。沉默CACUL1上调成脂分化的标志物PPARγ2、LPL和FABP4的mRNA和蛋白表达,下调成骨分化的标志物RUNX2、OCN和OPN的mRNA和蛋白表达。过表达CACUL1抑制成脂分化标志物的表达,促进成骨分化标志物的表达。结论:CACUL1在BMSCs成脂分化早期表达降低,而在成骨分化早期表达增高;CACUL1能抑制BMSCs成脂分化,促进其成骨分化;CACUL1可能是BMSCs定向分化过程中的关键因子,其促骨形成作用,可能成为治疗骨质疏松症的重要潜在靶点。第三部分CACUL1在BMSCs成骨分化过程中的分子机制研究目的:分析CACUL1在BMSCs成骨分化过程中的分子机制。方法:通过腺病毒载体过表达CACUL1,使用Western blotting方法检测BMSCs成骨分化过程中p-ERK1/2及ERK1/2的表达;应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126后,Western blotting方法检测成骨分化的标志物RUNX2的表达。结果:腺病毒过表达CACUL1后,RUNX2蛋白表达升高,同时p-ERK1/2的表达也升高,而EKR1/2的表达不变。使用抑制剂U0126后,p-ERK1/2的表达降低,而成骨标志基因RUNX2也显著降低。结论:CACUL1通过激活ERK1/2信号通路促进BMSCs向成骨细胞分化,促进骨质形成;由于CACUL1的促成骨作用,可能成为治疗骨质疏松症药物的潜在靶点。