目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),又被称作老年性痴呆,一般多于老年期发病,临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。阿尔茨海默病是以大脑中出现大量老年斑(SP)的形成、神经纤维缠结(NFTs)以及神经元细胞的大量丢失为主要病理改变的进展性神经系统退行性变疾病。根据世界卫生组织的报道,到目前为止,阿尔茨海默病在65岁以上老年人群中的发病率高达10%,而80岁以上的老年人群中,其发病率更是上升到40%以上。现在全世界大约有3500万的阿尔茨海默病患者,病人平均生存期为5到10年。阿尔茨海默病在老年人群中的致死率仅次于心脏病、恶性肿瘤和中风,排名第四位。按照老年人口比例以及发病率估算,目前中国已有超过1000万阿尔茨海默病患者,占亚太地区的40%,占世界约1/4。我国已成为阿尔茨海默病患者最多的国家。阿尔茨海默病带来的社会问题、经济问题、家庭问题以及公共卫生问题变得越来越严重,已经成为各国政府、公众以及广大医务工作者关注的焦点,中国也面临着比全球任何一个国家都更为严峻的阿尔茨海默疾病的挑战。至今仍未研究出能够有效治疗阿尔茨海默病或者阻断其病理进程的药物。阿尔茨海默病是美国十大死亡原因中,唯一一种既不可治愈,也不能阻止或减缓的疾病。从2012年至现在,6个阿尔茨海默症治疗药物也已夭折一半,但这仍不能阻止人们积极探索治愈阿尔茨海默症的信心。巴戟甲素是从巴戟天中分离出的一种单体,具有安全性高、药效确切、易于获得等特点。巴戟甲素在治疗AD方面有着巨大的研究价值,其作用靶点仍有待进一步的探索。本选题着眼于AD的一个重要致病因素Aβ的生成与降解,采用APP/PS1双转基因小鼠模拟AD病理和行为学特征,观察巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力以及脑内A β代谢、神经营养因子表达、神经炎症因子表达和突触结构稳定性的影响,阐明其神经保护作用机制及可能的作用靶点,为开发防治AD新药提供科学依据。方法:巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响:本研究选用7月龄APP/PS1双转基因小鼠30只(雄性),按随机区组设计以及体质量相近的原则进行分组,每组10只小鼠,分为模型组以及巴戟甲素低剂量组、巴戟甲素高剂量组。选择10只(雄性)同背景7月龄非转基因C57BL/6J小鼠作为野生对照组。全部小鼠饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级清洁鼠房。巴戟甲素低剂量组给予20mg/kg/d,巴戟甲素高剂量组给予80mg/kg/d灌胃,野生对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃,每日灌胃1次,持续给药4周。随后分别应用Morris水迷宫和新物体识别两个行为学试验,从宏观方面观察巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响。巴戟甲素对APP/PSl双转基因小鼠脑中A β代谢的影响:采用荧光定量PCR法检测APP/PS1双转基因小鼠脑中APP、PS1的基因水平。采用Western Blot检测APP/PS1双转基因小鼠脑中APP、PS1、BACE1、NEP、IDE等与Aβ生成及降解相关蛋白水平的变化,采用ELISA检测APP/PS1双转基因小鼠脑中A β 1-42含量的变化。采用硫黄素S染色法检测APP/PS1双转基因小鼠脑中老年斑数量的变化。巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中神经营养因子表达水平的影响:采用Western Blot检测APP/PS1双转基因小鼠脑中神经营养因子BDNF和NGF蛋白水平的变化。巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中神经炎症因子表达水平的影响:采用Western Blot检测APP/PS1双转基因小鼠脑中核转录因子NF-κ B以及TNF-α、IL-1β等中枢神经炎症相关因子表达水平的变化。巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中突触结构稳定性的影响:采用Western Blot检测APP/PS1双转基因小鼠脑中SYN、PSD-93和PSD-95等与突触结构相关蛋白水平的变化。结果:1.巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响Morris水迷宫测试结果:在为期5天的定位航行试验中,各实验组小鼠的逃避潜伏期随着训练时间呈缩短趋势。与模型组比较,野生对照组小鼠的逃避潜伏期缩短更为显著,差异有统计学意义(P<0.01)。且巴戟甲素低剂量组和高剂量组小鼠的逃避潜伏期均较模型组小鼠缩短更为显著,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。随后进行的空间探索测试结果,与模型组比较,野生对照组小鼠穿越原平台位置的次数以及在平台所在象限停留的时间均显著增多,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。且巴戟甲素高剂量组小鼠穿越原平台位置的次数以及在平台所在象限停留的时间也均较模型组小鼠增多,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。新物体识别测试结果:在第二天的学习期中,各实验组小鼠对两个物体的偏好程度并没有显著的差异,差异无统计学意义(P>0.05)。第三天的测试期结果,与模型组比较,野生对照组小鼠对新物体的偏好指数显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),且巴戟甲素高剂量组小鼠对新物体的偏好指数也较模型组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。2.巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中Aβ代谢的影响荧光定量PCR法检测结果显示,巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中APP和PS1基因水平的影响并不显著,差异无统计学意义(P>0.05)。Western Blot检测结果显示,巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中APP和PS1蛋白水平的影响并不显著,差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,巴戟甲素高剂量组小鼠脑中与Aβ生成相关蛋白BACE1的蛋白水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,巴戟甲素高剂量组小鼠脑中与A β降解相关蛋白NEP和IDE的蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。ELISA检测结果显示,与模型组比较,巴戟甲素高剂量组小鼠脑中A β 1-42含量显著减少,差异有统计学意义(P<0.01)。硫黄素S染色法检测结果显示,与模型组比较,巴戟甲素高剂量组小鼠脑中老年斑数量显著减少,差异有统计学意义(P<0.01)。3.巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中神经营养因子表达水平的影响Western Blot检测结果显示,与模型组比较,巴戟甲素高剂量组小鼠脑中神经营养因子BDNF和NGF的蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。4.巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中神经炎症因子表达水平的影响Western Blot检测结果显示,与模型组比较,巴戟甲素高剂量组小鼠脑中核转录因子NF-κ B的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,巴戟甲素高剂量组小鼠脑中神经炎症因子TNF-α、IL-1 β的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。5.巴戟甲素对APP/PS1双转基因小鼠脑中突触结构稳定性的影响Western Blot检测结果显示,与模型组比较,巴戟甲素高剂量组小鼠脑中SYN、PSD-93和PSD-95等与突触结构相关的蛋白水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。结论:两个行为学试验结果均表明,巴戟甲素能够一定程度上改善APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力。生化指标检测及病理学染色结果表明,巴戟甲素可能通过调控APP/PS1双转基因小鼠脑中A β代谢、神经营养因子水平、神经炎症因子表达以及维持突触结构的稳定性,发挥保护中枢神经系统的作用。巴戟甲素有希望成为防治中枢神经系统退行性疾病的新策略。然而,本研究的结果较为初步,更深入的作用机制原理仍有待进一步的研究。