研究背景：　　 2006年科学家发现可以通过转导4个基因将小鼠的皮肤细胞重编码为具有胚胎干细胞功能的干细胞，他们将这种细胞命名为诱导型多潜能干细胞(Induced Pluripotent stem Cells，iPS cells)。2009年中国科学家证实将iPS细胞植入四倍体囊胚，可以发育成小鼠活体，充分证明了iPS同胚胎干细胞功能上对等具有多能性(Pluripotent)，是一种全新的多潜能干细胞。iPS细胞同胚胎干细胞相似具有2大特点：即在体外能够无限自我更新和多能性(在适宜的条件下能够分化为机体3个胚层的所有细胞)，能够为人工肝，肝脏细胞移植和肝脏组织工程提供种子细胞。iPS细胞不需要破坏胚胎没有伦理压力和同时这些多潜能性干细胞来自病人本身没有HLA不匹配的问题，不存在免疫排斥的问题，所以iPS细胞是临床肝细胞非常理想的来源，使得肝病个体化研究和治疗有望成为现实。但是iPS细胞本身不具备肝细胞的功能，而且如果直接注入机体会产生畸胎瘤，在应用于治疗之前必需先将其分化为功能性细胞。所以探讨如何在体外使iPS细胞遵循正常肝脏胚胎发育通路定向分化为肝细胞是一项重要的工作。　　 目的：　　 探讨如何诱导小鼠iPS细胞遵循肝脏发育途径分化为具有合成、代谢、分泌及储存功能的肝细胞并探讨iPS来源确定性内胚层细胞(Definitive Endoderm，DE)和肝细胞体内移植可行性、效果和生物安全性。　　 方法：　　 1.设计全新的2步诱导法，首先iPS细胞诱导分化为ADE，再继续诱导分化为肝细胞。第一步在单层和无血清的培养条件下，分2个阶段序贯加入活化素A(ActinvinA)，骨形态蛋白4(BMP4)，基本纤维细胞生长因子(Basic fibroblastgrowth factor，bFGF)，表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)，序贯激活和协调Nodal信号和FGF信号转导通路，促使iPS细胞诱导分化为DE细胞。　　 2.第二步在建立DE细胞的基础上再次分2个阶段先加入BMP4和肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)，诱导DE细胞向肝细胞方向分化，在使用肝细胞专用培养基，加入HGF，肿瘤抑制因子(Oncostatin M,OSM)等生长因子使分化的IPS细胞进一步分化为成熟的肝细胞。3.应用Realtime RT-PCR细胞免疫荧光和流式细胞仪等方法从细胞形态，各阶段特色基因mRNA，各阶段特异性蛋白表达和各种肝细胞特异性功能检测4个层次对IPS来源的DE细胞和肝细胞进行鉴定。4.在建立小鼠肝急性肝损伤模型的基础上，采用性别差异性细胞移植，将雄性iPS来源ADE细胞和雄性iPS来源肝细胞通过门静脉移植到受损的肝脏，来观察这些分化的细胞能否在体内继续向肝脏细胞分化或维持肝细胞表型，同时评估iPS细胞治疗的生物安全性。　　 结果：　　 1.iPS细胞在分化的第6天，形态上由典型的iPS细胞克隆即细胞排列紧密，细胞之间界限不清逐步转变为细胞排列松散，细胞之间界限分明并呈现内皮样细胞状态；在mRNA水平，分化的过程中多潜能性基因如OCT4，Nanog表达逐渐下调，而DE特色基因如CXCR4，E-Cadherin,Sox17,FoxA2表达逐渐升高；同基因表达结果一致，在蛋白水平免疫荧光显示在分化的第6天，DE标志性转录因子Sox17和FoxA2明显高表达，同时90％的Sox17的阳性细胞同时表达FoxA2，流式细胞仪的检测提示在分化的第6天，DE细胞表面标记CXCR4表达可达85％，同时CXCR4+C-Kit或CXCR4+E-Cadherin双阳性细胞在分化的第6天达到约80％。2.在分化的第20天，分化细胞呈现多角形内皮细胞样形态，胞浆里出现糖原颗粒等肝细胞特色形态；分化的各时间段实时定量RT-PCR检测显示：在mRNA表达的水平，IPS细胞经历了肝细胞在体内从胚胎干细胞的发育过程，而早期肝细胞特异性mRNA表达如HNF4和AFP在分化的中期开始升高，肝细胞成熟特异性RNA如Albumin,TAT,CYP7Al,CFⅦ和Asgpr-1在分化的晚期才达高峰，同时AFP基因的表达较中期明显下调。同mRNA表达一致，在分化的第20天，免疫荧光实验提示大部分的肝脏细胞表达AFP，Albumin(阳性率80％)；流式细胞仪检测提示成熟肝细胞表面标志唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoproteinreceptor-1,Asgpr-1)(阳性率42.7％)。更为重要的是这些iPS来源肝细胞在体外具有典型成熟肝细胞的功能，能够摄取LDL,具备摄取和排出ICG能力，可以储存糖原，并能够分泌AFP，Albumin等蛋白和尿素。尤为重要的是这些iPS来源的肝细胞样细胞具有药物代谢酶细胞色素P450酶的活性。3.在移植DE细胞后的1周在雌性受体的肝脏内发现了Y染色体阳性细胞，这些细胞呈条索状，较移植后的第一天明显增生，同时大部分的Y染色体阳性的表达肝细胞特异性蛋白CYP2D6，提示这些D E细胞能够在体内继续分化为肝细胞。同时在iPS细胞来源的肝细胞移植后的1周我们同样发现了较大量的条索状Y染色体阳性细胞，大部分的细胞同时表达肝细胞特异性蛋白CYP2D6，提示本研究产生的iPS来源性肝细胞能够在受损的肝脏内存活并保持肝细胞的表型。然而在移植D E细胞的第6周我们发现受体的肝脏中出现了畸胎瘤。　　 结论：　　 1.iPS细胞能够在无血清单层培养的条件下，遵循体内肝脏胚胎早期发育的途径，定向分化为DE细胞。2.DE细胞能够进一步遵循肝脏发育的路径定向分化为肝细胞，具备具有合成、代谢、分泌及储存功能，并有药物代谢酶细胞色素P450酶的活性，有应用于药物开发的潜力。3.iPS来源DE细胞能够在体内继续发育为肝细胞同时iPS来源肝细胞能够在体内维持肝细胞表型，但同时如不去除未分化的iPS细胞，iPS细胞移植会有很高的畸胎瘤风险。IPS细胞来源肝细胞有希望应用于体外药物开发和人工肝种子细胞，但是iPS细胞治疗的临床应用尚需进一步的技术突破。