背景与目的多发性硬化症(MS)是一种典型的慢性炎症性、脱髓鞘疾病。临床表现以神经炎、共济失调、肢体瘫痪为主。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是人体多发性硬化症的一个非常成熟的动物模型,被广泛应用于研究免疫学机制。Pin1,是肽酰脯氨酰顺/反式异构酶细小蛋白亚家族中的一员,其对许多关键蛋白的构象调节对多种重要的细胞活动都具有很深远的影响。有研究表明Pin1在哮喘的发展和微生物感染等免疫系统相关疾病中起了重要作用。但Pin1在自身免疫系统疾病中发挥的功能及其机制报道很少。本研究的目的是通过体外实验和体内实验相结合的方法初步探讨Pin1对EAE中自身免疫炎症导致疾病发生的作用及机制,以及Pin1调节自身免疫性脑脊髓炎发生发展的细胞机制,为多发性硬化症及其他T淋巴细胞有关的自体免疫性疾病的临床研究提供参考与借鉴。方法本论文主要从EAE小鼠整体及病理分析、Pin1对EAE小鼠脊髓和外周淋巴结中及各T细胞亚群的调节作用和Pin1对EAE小鼠致病作用的体外研究三方面进行论述。首先构建EAE的小鼠动物模型,并将20只小鼠分成两组,每组10只,实验组在诱导前一周尾静脉注射重组慢病毒载体用来敲低Pin1,对照组在诱导前一周尾静脉注射空白慢病毒载体。免疫诱导后,开始进行观察记录,并及时进行临床评分。随即我们收集EAE疾病小鼠的脊髓,应用HE染色和Luxol Fast Blue染色,以检测脊髓炎症浸润程度和脊髓脱髓鞘情况。接下来我们收取EAE疾病小鼠新鲜的脊髓及外周淋巴结,获得所得单个核细胞,通过流式细胞仪检测脊髓和外周淋巴结中T淋巴细胞亚群浸润情况及比例变化。最后体外研究Pin1对EAE的致病作用,我们收取EAE疾病小鼠新鲜的脾脏和淋巴组织,分离单个核细胞,用流式细胞仪检测细胞增殖情况和DC细胞表面表达情况。体外利用敲低Pin1的树突细胞系和淋巴细胞系,反转录RNA,用荧光定量PCR研究炎症因子的表达情况和Th17相关的基因的表达情况。结果1.敲低Pin1后EAE小鼠临床病理分级变化。与对照组相比,敲低Pin1抑制EAE发生发展;敲低Pin1的EAE小鼠从发病起始时间推迟了2天,EAE发病整体表现比较平缓,临床评分的统计结果表现总体降低,与对照组相比,存在统计学上的显著差异。此外,发现敲低Pin1的EAE小鼠临床评分平均总分和平均最高分显著下降,发病率与对照组相比也明显降低。2.小鼠脊髓炎症情况及脱髓鞘的表现。经小鼠的腰髓组织的石蜡切片进行HE染色发现:对照组小鼠的腰髓节段区域的脊髓白质部分(即负责神经传导的神经轴突区域),聚集了大量的炎症细胞,形成深色的片状区;与之形成鲜明对比的是敲低Pin1的EAE小鼠脊髓白质区域,炎症细胞的组织浸润程度大大降低,没有形成明显的炎症细胞群。染色剂固蓝可以特异性地与神经髓鞘部分相结合,实现特异性地呈现神经髓鞘的脱落。染色实验结果发现:与对照组相比,敲低Pin1脱髓鞘斑片状蓝色缺失明显减少,说明小鼠脊髓的脱髓鞘受到了抑制。3.敲低Pin1抑制了EAE小鼠淋巴组织效应T细胞Th17/Th1亚群的分化。敲低Pin1可以明显降低小鼠外周淋巴结中的Th17与Th1细胞比例;进一步通过流式细胞仪检测中枢神经系统(脊髓)中的细胞,结果发现敲低Pin1可以明显降低小鼠脊髓中的Th17细胞比例。4.敲低Pin1可以抑制树突细胞DC的成熟与分化。敲低Pin1后,EAE小鼠的DC对特定抗原的提呈能力减弱,相对应的表面标记CD83和MHC-II表达明显降低;DC细胞系中促炎因子IL-6和IL-1β表达水平降低,而抗炎因子IL-10表达水平升高。5.敲低Pin1可以降低T淋巴细胞的活化及相关炎症基因的表达。敲低Pin1后的小鼠其淋巴结中T细胞对特定抗原刺激的增值能力明显减弱,其功能受到明显抑制;T细胞系EL4细胞中,敲低Pin1明显降低Th17相关的基因IL-17A、IL-17F与STAT3表达水平。结论敲低Pin1减轻了实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的脊髓组织中累积的炎症细胞,大大缓解了发病小鼠脊髓的脱髓鞘症状;敲低Pin1抑制EAE发生发展;沉默Pin1对EAE具有抑制作用,可以作为治疗EAE的靶点;敲低Pin1可以明显降低小鼠外周淋巴结中的Th17比例;敲低Pin1可以明显降低小鼠外周淋巴结中的Th1比例,肯定了Pin1对EAE的调控作用和EAE中自身免疫炎症反应的调节作用。总之,敲低Pin1能够有效改善实验性小鼠脑脊髓炎。Pin1既可以通过调节DC从而影响Th细胞分化,也可以直接影响Th细胞分化。Pin1对Th17细胞及其介导EAE中自身免疫炎症反应的调节作用的研究结果,对于全面了解MS/EAE等神经系统炎症疾病的病理发生具有重要意义,有望成为相关疾病诊断和治疗的新靶点。