1研究背景下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HSCC)是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤,大约占所有头颈部肿瘤的3-5%,其发病部位隐蔽,原发灶呈多中心生长,侵袭极性强,并易于粘膜下扩散。晚期下咽癌常可累及喉咽周围的颈段食管、喉腔、舌根等重要器官。另外,由于喉咽淋巴引流丰富,癌细胞极易发生颈部淋巴结转移和包膜外侵犯,侵犯包括颈部大血管在内的重要器官。下咽癌预后极差。5年总体生存率约为15-45%。以顺铂为基础的化疗是下咽癌非手术治疗及术后放化疗的重要组成部分。然而,由于下咽癌细胞本身对化疗敏感性较差并且容易在治疗过程中对化疗药物产生耐药性,顺铂等药物在下咽癌化疗中的作用常常受到严重影响。数十年来,如何有效的克服下咽癌对顺铂等化疗药物的耐药性、提高其对化疗的敏感性仍是耳鼻咽喉头颈科学的一个难题。自噬(Autophagy)是真核细胞内过剩的大分子物质和废旧细胞器等包被胞质内双层模状结构裹后,最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体并被溶酶体酶消化分解成小分子物质后回收再利用的过程。自噬广泛参与细胞的生长、增殖、分化、凋亡过程,并在生命体的生长、发育、衰老、疾病及死亡中起重要作用。自噬对胞内过剩或错误折叠的蛋白质、脂质、细胞器以及侵入的病原体等的吞噬消化作用,对于细胞维持自身内环境的稳定十分重要；并且,被回收再利用的小分子物质能够为细胞的基本生命活动提供能源和材料供给,这对处于营养匮乏条件下细胞尤其重要。自噬功能缺陷可能会导致各种疾病的发生,如肿瘤、神经系统退行性变等。自噬在肿瘤的发生、发展、转移及治疗过程中的作用十分复杂。一般认为,细胞通过自噬的自净作用维持细胞稳态,防止细胞癌变的发生；然而发生癌变的细胞能够在缺乏营养和氧气的极端条件下利用自噬提供的能源和材料维持生存,逃避死亡；自噬作用也被认为能提高失巢肿瘤细胞对新的微环境的适应性而促进肿瘤细胞的转移；在肿瘤的治疗中,自噬可能参与肿瘤细胞耐药性的形成。另外,在不同的肿瘤中,自噬扮演的作用可能并不一致,有时甚至完全相反。自噬在肿瘤中的具体作用具有背景依赖性和肿瘤类型依赖性。氯喹(Chloroquine, CQ)是一种被广泛应用于治疗疟疾和类风湿的药物。在自噬的相关研究中,氯喹也是一种最常用的自噬调节剂。氯喹作用于自噬过程的终末阶段,通过影响溶酶体的酸化阻止自噬包裹物的降解过程。氯喹及其衍生物作为自噬调节剂的优点是药理作用研究比较透彻,用药安全性高；它们也是目前能够唯一安全应用于体内的自噬抑制药物。将经典药物氯喹作为自噬调节剂用于肿瘤的治疗很有探索价值。但目前关于氯喹在各种肿瘤治疗中的作用还有很大争议。已有报道氯喹在肝癌、结直肠癌、食管癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的治疗中可能具有促进肿瘤细胞死亡、增加肿瘤细胞对化学药物和射线治疗敏感性的作用；然而在小细胞肺癌等的研究中,氯喹并无单独抗肿瘤或者提高肿瘤细胞对药物、射线敏感性的作用。氯喹在人下咽鳞状细胞癌治疗中的作用还未见报道。本研究以下咽癌FaDu细胞作为研究对象,将自噬抑制剂氯喹单独或联合化疗药物顺铂(DDP)应用于下咽癌FaDu细胞体外治疗和BALB/c免疫缺陷小鼠种植瘤的治疗,探讨氯喹的自噬调节作用对下咽癌治疗的影响。2研究目的(1)研究氯喹的自噬调节作用对下咽癌FaDu细胞生长的影响；(2)通过体外实验和BALB/c免疫缺陷小鼠人下咽癌种植瘤模型体内实验研究氯喹联合化疗药物顺铂对下咽癌FaDu细胞的治疗作用,并进一步探讨其作用机制。3 实验方法3.1 细胞培养本实验所用细胞系为人下咽癌FaDu细胞系,购自美国模式培养物集存库(American type culture collection, ATCC);细胞培养用RPMI 1640培养基,添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素,37℃,5% CO2恒温,恒湿条件培养。3.2试剂和抗体应用于本实验的试剂包括：顺铂,氯喹；抗体包括：兔抗人LC3B抗体,兔抗人Beclin-1抗体,兔抗人Bax抗体,兔抗人Bcl-2抗体,兔抗人p62抗体,兔抗人β-actin抗体。3.3细胞增殖与活力检测采用日本同仁Cell Counting Kit (CCK-8) WST-8试剂盒。细胞活力计算公式为：细胞活力%=[A(加药)-A(空白)]/[A(不加药)-A(空白)]×100。3.4 RNA干扰Beclin-1 siRNAs和Scrambled siRNAs以及Beclin-1 shRNA表达重组慢病毒均由上海吉玛制药技术有限公司设计提供。Beclin-1 siRNAs序列(5’to 3’):GTGGAATGGAATGAGATTA;Scrambled siRNAs序列(5’to 3’):TTCTCCGAACGTGTCACGT。3.5动物模型的建立选5-6周龄雄性BALB/c免疫缺陷小鼠28只,小鼠侧腹部皮下注射含3×106人下咽癌FaDu细胞的HANKS缓冲盐悬液100μ1。肿瘤细胞种植后7天,种植瘤体积增长至约5×5mm。根据种植瘤的大小匹配,随机将BALB/c免疫缺陷小鼠分为4组(n=7)并开始相应的药物腹腔注射治疗：对照组(生理盐水100μl/天),氯喹组(CQ,60 mg/kg/天),顺铂组(DDP,5 mg/kg/6天),氯喹联合顺铂组(CQ,60mg/kg/天+DDP,5 mg/kg/6天)。顺铂注射一共分3次进行。实验过程中每天密切观测荷瘤小鼠的生存状态；每3天用游标卡尺测量肿瘤最长径和最短径,肿瘤体积计算公式：肿瘤体积=长×宽2/2；同时每3天对小鼠称重记录以评估药物毒性。治疗18天后对小鼠腹膜腔注射0.8%戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉、脱颈行安乐死,收集肿瘤标本备用。3.6生存分析小鼠肿瘤接种、分组、给药及监测同上。治疗18天后,继续各组治疗(其中顺铂一共给予3次后停止给药,其他治疗继续)。每天密切观察小鼠生存状态。小鼠死亡判定标准为：1)接种瘤出现表面皮肤破溃或坏死；2)肿瘤的最长径超过2cm；3)肿瘤的生长使小鼠处于将死状态(精神萎靡,拒绝饮食,体重下降超过20%)。3.7 Western blot免疫印迹收集人下咽癌FaDu细胞和其BALB/c免疫缺陷小鼠种植肿瘤用于提取蛋白,Western blot检测LC3,p62,Bax,Bcl-2等的表达。3.8免疫组织化学IHC收集BALB/c免疫缺陷小鼠种植肿瘤组织,免疫组织化学技术检测LC3和p62蛋白的表达。3.9 TUNEL凋亡检测TUNEL过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒用于检测组织细胞凋亡。3.10统计分析该课题采用Prism 5.0(GraphPad SOftware Inc.,USA)和SPSS16.0作为统计软件。数据比较采用0 ne-way analysis of variance(One-way ANOVA)或t-检验。实验动物的生存分析用log-rank检验。细胞实验重复至少3次。实验结果表示为均数±标准误。P<0.05被认为具有统计学差异。4结果4.1细胞实验部分4.1.1顺铂对FaDu细胞生长的剂量、时间效应关系在正常培养条件下,应用不同浓度的顺铂(0,0.2,0.5,1,2.5,5μM)对FaDu细胞刺激24小时和48小时后,用CCK8进行细胞活力分析。结果显示：随着顺铂刺激浓度的增加和刺激时间的延长,FaDu细胞活力呈逐渐下降趋势。顺铂对FaDu细胞生长抑制作用呈现剂量-效应和时间-效应依赖关系。顺铂刺激48小时的IC50为2.512μM(2.230-2.828 μM,95％CI).因此,我们选择顺铂浓度2.5μM作为进一步的实验浓度。4.1.2氯喹对FaDu细胞生长的作用在正常培养条件下,应用不同浓度的氯喹(0,5,10,15,20,25 μM)分别刺激FaDu细胞24、48、72、96、120小时后,用CCK8进行FaDu细胞活力分析。结果表明,较低浓度氯喹(5,10μM)处理24、48、72、96、120小时对细胞的增殖活性并无明显影响。较高浓度氯喹(15,20,25μM)刺激时,FaDu细胞的增殖活性呈现逐渐下降趋势,呈现时间-效应和剂量-效应依赖关系。4.1.3氯喹对FaDu细胞的自噬抑制作用在正常培养条件下,应用0,10 μM的氯喹刺激FaDu细胞24小时,收集细胞并提取蛋白,用western blot检测FaDu细胞自噬标志物LC3和p62蛋白表达。结果显示：与对照组细胞相比,氯喹(10μM)能明显提高FaDu细胞LC3Ⅱ和p62蛋白水平。提示在正常培养条件下,氯喹(10μM)能够抑制FaDu细胞的自噬活动。结合以上实验结果,较高浓度氯喹(15,20,25 μM)虽然能够影响FaDu细胞的增殖活性,但不能排除其高浓度产生的毒性作用；较低浓度氯喹(10μM)不影响FaDu细胞增殖活性,但已经足够抑制FaDu细胞的自噬活动,因此我们选择氯喹(10μM)作为进一步实验浓度。4.1.4顺铂对FaDu细胞的自噬诱导作用在正常培养条件下,应用顺铂(0,2.5μM)对FaDu细胞刺激48小时后,收集细胞提取蛋白,Western blot检测自噬相关蛋白LC3和p62的表达情况。结果显示：顺铂刺激明显增加了FaDu细胞中LC3 Ⅱ蛋白表达水平,p62蛋白水平则明显降低。提示顺铂(2.5μM)刺激能使FaDu肿瘤细胞自噬水平上调。4.1.5氯喹的自噬抑制作用对FaDu细胞顺铂敏感性的影响应用氯喹(0,10μM)对FaDu细胞刺激24小时后,培养基内加入顺铂(2.5μM)继续刺激48小时。应用CCK8检测各组细胞活力。与单独顺铂刺激组相比,氯喹(10μM)联合顺铂刺激组细胞增殖活力明显下降；氯喹(10 μM)能明显增加顺铂对FaDu细胞生长的抑制作用。4.1.6氯喹联合顺铂对FaDu细胞凋亡的影响应用氯喹(0,10μM)对FaDu细胞刺激24小时后,培养基内加入顺铂(2.5gM),继续培养48小时。48小时后收集细胞、提取蛋白,用Western blot检测FaDu细胞促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结果显示：与单独顺铂刺激组相比,氯喹(10 gM)联合顺铂(2.5μM)刺激组FaDu细胞促凋亡蛋白Bax表达明显升高、抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降,Bax/Bcl-2值显著增大。提示氯喹联合顺铂刺激能够明显增加FaDu细胞凋亡。4.1.7 Beclin-1 siRNA对FaDu细胞顺铂敏感性的影响Beclin-1 siRNA和对照siRNA转染FaDu细胞24小时后,继续用顺铂(2.5μM)刺激48小时。应用CCK8检测各组细胞活力。结果显示：单独Beclin-1 siRNA对FaDu细胞活力并无明显抑制作用；与对照siRNA组相比,Beclin-1 siRNNA却能够明显提高顺铂对FaDu细胞生长抑制作用。提示抑制自噬能够提高FaDu细胞对顺铂的敏感性,抑制自噬是低浓度氯喹(10μM)增强FaDu细胞对顺铂敏感性的一种可能机制。4.2动物实验部分4.2.1 BALB/c免疫缺陷小鼠的FaDu种植瘤生长情况监测不同组的小鼠分别接受以下治疗：生理盐水对照(生理盐水0.1ml/天)、氯喹(60mg/kg/天)、顺铂(5mg/kg/6天)、氯喹(6Omg/kg/天)+顺铂(5mg/kg/6天)。治疗期间监测肿瘤体积增长情况。实验结果表明：单独氯喹治疗组肿瘤体积增长和最终肿瘤重量(1455.0±137.2 mm3,0.983±0.049 g)与对照组(1405.0±117.2 mm3,0.981±0.0577 g)相比无明显差异；单独顺铂治疗组的肿瘤体积和最终肿瘤重量(657.0±66.2 mm3,0.493±0.0496g)与生理盐水对照相比有明显减少(p<0.001)；顺铂和氯喹联合治疗组的肿瘤体积和肿瘤重量(350.7±54.0mm3,0.263±0.0405 g)与单独顺铂组相比有显著减少(p<0.01)。提示单独氯喹治疗对FaDu种植瘤生长无明显抑制作用；但在顺铂和氯喹联合应用的情况下,氯喹却能明显增强顺铂对下咽癌FaDu种植瘤的生长抑制作用。4.2.2 BALB/c免疫缺陷小鼠的荷瘤生存时间监测绘制Kaplan-Meier曲线以评估各处理组的小鼠荷瘤生存时间。实验结果显示：单独氯喹治疗方案对小鼠荷瘤生存时间并无明显影响；单独顺铂治疗组小鼠的荷瘤生存时间与生理盐水对照组相比有明显增加(p<0.01)；与单独顺铂治疗组相比,顺铂和氯喹联合治疗方案能够显著延长小鼠荷瘤生存时间(p=0.0113,log-rank检验)。顺铂和氯喹联合治疗方案使小鼠荷瘤生存中位时间比单独顺铂治疗方案延长了15.5天。4.2.3 BALB/c免疫缺陷小鼠的体重监测监测各治疗组小鼠的体重变化,以评估各治疗方案在用药期间对实验小鼠的全身毒副作用和用药安全性。单独应用氯喹治疗(60mg/kg/天)并不会引起小鼠体重的明显变化；与生理盐水对照组相比,单独应用顺铂治疗则会导致荷瘤小鼠体重明显下降(p<0.001),这与顺铂本身的副作用有关。与生理盐水对照组相比,顺铂和氯喹联合治疗方案也会引起小鼠体重的明显下降(p<0.001)。但值得注意的是,顺铂和氯喹联合治疗方案引起的小鼠体重下降水平与单独顺铂治疗组相比并无明显统计学差异,提示顺铂和氯喹联合治疗方案并不进一步增加顺铂本身的全身毒副作用。4.2.4顺铂、氯喹治疗对FaDu细胞的自噬调节作用(1)顺铂治疗对FaDu细胞的自噬诱导作用对所收集的各处理组肿瘤的自噬相关蛋白LC3和p62的表达情况进行了Western blot和免疫组织化学分析。分析结果显示：与生理盐水对照组相比,顺铂(5mg/kg/6天)明显增加了FaDu肿瘤细胞中LC3Ⅱ蛋白表达,p62积聚水平明显降低,提示顺铂在体内应用时对FaDu肿瘤细胞具有明显的自噬诱导作用。(2)氯喹对FaDu肿瘤细胞的自噬抑制作用应用Western blot和免疫组织化学技术对收集的氯喹处理组肿瘤做了自噬相关蛋白LC3和p62的表达情况分析。分析结果显示：与生理盐水对照组相比,在氯喹(6Omg/kg/d)治疗18天后的FaDu种植瘤中自噬相关蛋白LC3和p62在细胞中积聚水平都明显增高。提示氯喹作为一种最常用的自噬抑制剂,在连续多日腹膜腔注射(60mg/kg/d)应用的情况下,对人下咽癌FaDu种植瘤能够产生明显自噬抑制作用。然而,体内实验中氯喹的抑制自噬作用需要一定时间才能呈现出来。连续氯喹(6Omg/kg/天)治疗1天、3天和7天后对肿瘤组织切片后进行免疫组织化学分析显示,连续氯喹治疗1天和3天后肿瘤细胞内LC3水平和对照组相比并无明显差异；连续氯喹治疗7天后免疫组化结果显示肿瘤细胞内方可见明显LC3积聚,提示氯喹(6Omg/kg/天)在体内实验中引起FaDu肿瘤细胞自噬抑制大约需要1周时间。(3)顺铂联合氯喹治疗方案对FaDu肿瘤细胞自噬水平的影响应用、Western blot和免疫组织化学分析了顺铂联合氯喹治疗组的FaDu肿瘤细胞LC3和p62表达水平。分析结果显示：与单独顺铂治疗组相比,联合治疗组的FaDu肿瘤细胞LC3 Ⅱ和p62蛋白水平都进一步增高。提示在联合治疗方案的干预下,氯喹能够有效抑制顺铂所诱导的自噬活动。4.2.5顺铂、氯喹治疗对FaDu种植瘤细胞凋亡的影响(1)顺铂治疗对FaDu种植瘤细胞凋亡的影响对顺铂治疗组种植瘤行凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的免疫印迹分析,并对Bax/Bcl-2值进行统计分析。与生理盐水对照组相比,顺铂组的肿瘤细胞促凋亡蛋白Bax表达明显增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少,Bax/Bcl-2值明显增大。TUNEL染色显示顺铂组的肿瘤细胞凋亡比生理盐水对照组明显增多。提示顺铂在体内可明显诱导下咽癌细胞的凋亡。(2)氯喹对FaDu种植瘤细胞凋亡的影响对氯喹处理组种植瘤的凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2进行分析,并行TUNEL染色。结果表明：氯喹治疗组细胞凋亡水平与生理盐水对照组相比没有统计学差异,单独氯喹治疗并不增加FaDu种植瘤细胞凋亡。(3)氯喹联合顺铂对FaDu种植瘤细胞凋亡的影响对单独顺铂治疗组和联合治疗组FaDu种植瘤细胞的凋亡情况进行分析。分析结果表明：与单独顺铂治疗相比,联合治疗组的肿瘤细胞促凋亡蛋白Bax表达进一步增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达则进一步减少,Bax/Bcl-2值明显增大。TUNEL染色显示联合用药组的肿瘤细胞凋亡比顺铂组进一步增多。提示氯喹能够明显增加顺铂诱导的FaDu细胞凋亡,氯喹对顺铂治疗下咽癌FaDu种植瘤具有明显的增敏作用。4.2.6抑制Beclin-1对人下咽癌FaDu种植瘤的影响通过Beclin-1 shRNA’慢病毒载体转染下咽癌FaDu细胞,抑制自噬相关蛋白Beclin-1在肿瘤细胞中的表达并筛选了Beclin-1表达稳定抑制的细胞建立动物模型。实验过程中对种植瘤体积增长进行监测。与对照shRNA组相比,Beclin-1抑制对FaDu种植瘤的生长并无明显影响,提示下咽癌细胞在未受化疗药物应激的情况下,自噬抑制并不明显影响肿瘤细胞的生长。将顺铂+对照shRNA组和顺铂+Beclin-1 shRNA组的肿瘤生长情况进行对比分析。结果显示：与顺铂+对照shRNA组相比,顺铂--Beclin-1 shRNA组的FaDu种植肿瘤的生长受到明显抑制。提示抑制自噬能够明显增加化疗药物顺铂对下咽癌FaDu细胞的抑制作用；抑制自噬是氯喹增强下咽癌FaDu细胞对顺铂敏感性的一种可能机制。5结论(1)氯喹对下咽癌细胞具有自噬调节作用；(2)顺铂诱导的自噬水平升高可能参与下咽癌细胞对顺铂耐药性的形成；(3)氯喹对顺铂治疗下咽癌具有增敏作用,氯喹能增加顺铂诱导的下咽癌细胞凋亡；(4)自噬抑制是氯喹增敏顺铂治疗下咽癌的可能机制。