研究背景乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,且以每年0.8%的趋势上升。大部分乳腺癌以50～54岁的女性为高发人群,仅1%左右的乳腺癌发生于男性。乳腺癌的转移和复发是导致乳腺癌病人死亡的主要原因。乳腺癌转移的过程高度复杂,涉及多个信号通路,受到多种因子的调节。虽然目前已有大量的与乳腺癌转移相关的文献报道,但是乳腺癌转移机制仍然不明确,缺乏系统性及全面性的研究,尤其是在乳腺癌转移中起关键作用的蛋白及蛋白-蛋白之间的相互作用,目前没有系统性的统计与报道。蛋白与蛋白之间的相互作用构成复杂的细胞内外信号网络,同时精确调控着人体的各种生理过程。蛋白之间的互相作用,尤其与信号通路相关蛋白之间的作用可影响生物学功能。Wei Wang等综述了30多种与Nuclear factor kappa-light-chain-enhancef of activated B cells (NF-κB)信号通路蛋白具有相互作用的蛋白。EZH2与p65/RelA相互作用能诱导ER-乳腺癌细胞中NF-κB的转录活性,但在ER+乳腺癌细胞中作用相反；Estrogen Receptor与p65可以互相抑制彼此的活性；Notch-I与IKKa作用可以抑制NF-κB的激活；β-TRCP与IκB-α作用,可通过蛋白酶系统诱导Iκ-α的重组,从而促进其酶体的降解,激活NF-κB通路；HSP 27与IKKα/β的相互作用,能抑制NF-κB的活性。因此,从与乳腺癌转移相关的蛋白及蛋白-蛋白之间的相互作用(protein-protein interactions, PPIs)入手,深入研究乳腺癌转移的机制,是研究乳腺癌转移及对乳腺癌进行治疗和预防的重要手段。Ezrin全长586个氨基酸,其ERM结构域N端由296个氨基酸组成FERM结构域,C端由107个氨基酸组成C-ERMAD,这两个结构域使得Ezrin在休眠与激活两种状态下转换。Ezrin通过改变细胞微绒毛的结构,从而改变细胞的形态,调节细胞与细胞之间的粘附作用以及各项生理活动,从而影响细胞的侵袭、迁移能力。例如,表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是转移中具有重要作用的细胞因子,活化的Ezrin在对EGF的应答中有着不可或缺的地位。Ezrin与乳腺癌转移密切相关,同时能影响乳腺癌的预后,在乳腺原位癌细胞系MCF10A及转移型细胞系MDA-MB-231中,沉默Ezrin均能降低其侵袭能力。Mak等人发现,Src/Ezrin的相互作用能够调节乳腺原位癌的转移和侵袭,而Wan等人发现,β4 integrin/Ezrin的相互作用能够调节骨肉瘤的肺转移。因此,Ezrin及其相互作用蛋白的互作在乳腺癌转移和侵袭机制的研究中非常重要,这也往往涉及不同信号通路的激活和互作。研究发现,Ezrin与其它蛋白的相互作用能影响不同的恶性肿瘤的进程。Harrison等人在前列腺癌细胞中发现,Ezrin与CD44存在相互作用,且通过染色体易位,Ezrin/CD44参与调节前列腺癌细胞和上皮细胞的互作,影响前列腺癌细胞的转移和侵袭。Brownd等人在口腔癌细胞中发现,Ezrin与Dsg3蛋白的互相作用可增加口腔癌细胞系的转移潜能。有关Ezrin与NF-κB信号通路的研究不多。NF-κB是一个细胞核转录因子蛋白家族,其信号通路的激活被认为是应激反应中的一个重要环节,调节着许多与凋亡,病毒复制,肿瘤生长,炎症反应,以及自身免疫疾病相关的关键基因的表达。据报道,NF-κB信号通路在炎性乳腺癌(Inflammatory breast cancer, IBC)中被激活,且呈持续高表达。另一个具有持续激活的NF-κB信号通路的乳腺癌亚型是三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer, TNBC)。目前临床上对于NF-κB与乳腺癌的研究显示,NF-κB的活化通常与乳腺癌肿瘤的大小,乳腺癌肺转移、脑转移,以及HER2蛋白表达有关。NF-κB包括五个亚单位,Rel(cRel),p65(RelA,NF-κB3),RelB,p50(NF-κB1)和p52 (NF-κB2)。最常见的NF-κB二聚体由p65和p50组成。NF-κB p65不仅广泛存在于各种细胞中,并且其已被证实与具有调控多种有关免疫和炎症反应的基因的转录表达有关。非恶性肿瘤细胞MCF-10A中,过表达的p65亚基能够促进上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT).另外,NF-κB-p65与肿瘤的生长、增殖、侵袭和迁移也有着密切的关系,同时调节着肿瘤细胞的凋亡和免疫活性。因此,Ezrin蛋白与NF-κB信号通路蛋白互相作用能否影响乳腺癌迁移和侵袭,值得关注。另一方面,目前也缺乏Ezrin与Smad蛋白家族的相互作用的研究。Smad蛋白家族是转化生长因子β (transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的重要细胞因子,其介导不同的TGF-β家族成员由细胞质传导入细胞核,与TGF-β共同担负起调节细胞生长、分化、凋亡等的生理过程。Smad2属于受体调控Smad蛋白(receptor regulated Smads, R-Smads),参与哺乳动物信号传导通路的调节。Petersen等人在对乳腺癌肿瘤骨转移的研究中发现,沉默Smad2能够促进MDA-MB-231细胞的侵袭。Chen等人发现磷酸化的Smad2可作为不同肿瘤进程的非小细胞肺癌患者预后不良及生存不良的标志。Liao等人研究发现,SIAH2蛋白可以与Smad2相互作用,调节Smad2的降解和泛素化。然而,目前尚未有研究证明Ezrin是否与Smad2存在相互作用,且该互作对乳腺癌细胞转移和侵袭功能是否存在影响,都是未知数。因此,Ezrin与Smad2之间相互作用的研究及其对癌细胞转移的影响,值得关注。目前,研究目标蛋白相互作用网络的方法有很多,包括免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP),串联亲和层析(Tandem affinity purification, TAP),酵母双杂交(Yeast 2 hybrid, Y2H), pulldown,2D电泳(Two-dimensional electrophoresis),免疫荧光(Immunofluorescence, IF)共定位等。通过免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)的方法得到的样品,经过电泳分析,对目的条带进行切胶回收,然后行液质联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LCMS)分析,可以筛选出相互作用的蛋白。本研究中,我们采取IP联用LCMS,在乳腺癌细胞MDA-MB-231中得到基于与Ezrin相互作用的蛋白网络,发现Ezrin与p65和Smad2之间存在相互作用。随后,我们用Co-IP和IF法验证了Ezrin与p65和Smad2之间的相互作用,并初步研究了其相互作用对于乳腺癌细胞的侵袭和增殖的影响。研究目的1.研究乳腺癌细胞中基于与Ezrin相互作用的蛋白谱,选择其中的p65和Smad2进行与Ezrin相互作用的鉴定；2.初步研究Ezrin与p65或Smad2之间的相互作用对于乳腺癌细胞侵袭和增殖能力的影响。研究方法1.乳腺癌细胞的培养常规复苏高侵袭性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231及低侵袭性的乳腺癌细胞株MCF-7。MDA-MB-231培养于含有10%血清(fetal bovine serum, FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mmol/L谷氨酰胺(Glutamine, Gln)的L-15培养基中,于37℃、不含CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养；MCF-7培养于含有10% FBS,100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mmol/L Gln的DMEM培养基中,于37℃,5%CO2,饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞汇合度达到90%,用0.25%胰蛋白酶(胰酶,含0.02% EDTA)消化,进行传代及扩大培养。2.免疫沉淀(IP)及液质联用(LCMS)第一次IP联用LCMS检测：提取MDA-MB-231全细胞裂解液,通过IP实验,沉淀与Ezrin相互作用的蛋白,取部分行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate- polyacrylamide gel electrophresis, SDS-PAGE)和考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue, CBB)染色,观察Ezrin与相互作用蛋白的富集情况,确定IP实验有效；剩下的样品送至深圳华大基因公司行LCMS检测,分析数据并挑选兴趣蛋白。第二次IP联用LCMS检测：提取MDA-MB-231全细胞裂解液,以IgG作为对照,通过IP实验,沉淀与Ezrin相互作用的蛋白,行SDS-PAGE和银氨染色,观察Ezrin与相互作用蛋白的富集情况,确定IP实验有效；回收蛋白胶条,连同IgG对照,一起送至深圳华大基因进行LCMS检测,确定蛋白相互作用。3.免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白免疫印迹(Western Blot, WB)及免疫荧光(IF)3.1细胞浆和细胞核蛋白提取及免疫共沉淀(Co-IP)提取及分离MDA-MB-231和MCF-7细胞胞浆和胞核蛋白,分别用抗Ezrin、 p65或Smad2抗体行Co-IP,检测Ezrin/p65, Ezrin/Smad2在胞浆和胞核中的相互作用。3.2免疫印迹(WB)WB检测MDA-MB-231和MCF-7细胞中,Ezrin/p65, Ezrin/Smad2蛋白表达水平和PPIs。3.3免疫荧光(IF)对MDA-MB-231和MCF-7细胞中Ezrin/p65, Ezrin/Smad2蛋白进行IF染色,通过激光共聚焦检测并确定Ezrin/p65, Ezrin/Smad2蛋白的表达及共定位。4.3×Flag-Ezrin-6xHis质粒构建与转染4.13×Flag-Ezrin-6xHis质粒构建pcDNA3.1用于构建含有Flag和His标签及Ezrin蛋白全长编码序列的质粒3×Flag-Ezrin-6xHis,将该质粒转化入DH5α进行扩增并提取。4.2质粒转染、免疫共沉淀(Co-IP)及免疫荧光(IF)质粒转染设置组：①共转染3×Flag-Ezrin-6×His和GFP-RelA (GFP-p65)质粒；②共转染3×Flag-Ezrin-6×His和Smad2-HA质粒。CoIP:提取及分离MDA-MB-231和MCF-7细胞胞浆和胞核蛋白,分别行Co-IP验证Ezrin/p65, Ezrin/Smad2在胞浆和胞核中的PPIs。IF：对MDA-MB-231和MCF-7细胞中Ezrin和p65, Ezrin和Smad2蛋白进行IF染色,通过激光共聚焦检测并确定Ezrin/p65, Ezrin/Smad2蛋白的表达及共定位。5.Transwell检测乳腺癌细胞侵袭能力5.1沉默和过表达目的蛋白组别设置为了验证Ezrin/p65相互作用对乳腺癌细胞侵袭的影响,设置组别分别为：①空载组；②沉默Ezrin:③沉默p65；④过表达p65；⑤沉默Ezrin过表达p65。为了验证Ezrin/Smad2相互作用对乳腺癌细胞侵袭的影响,设置组别分别为：①空载组；②沉默Ezrin:③沉默Smad2:④过表达Smad2:⑤沉默Ezrin过表达Smad2.5.2 Transwell检测乳腺癌细胞侵袭能力将按照上述组别设置处理过的乳腺癌细胞转入已经铺有Matrigel的Transwell小室,培养18h后,擦去小室上层中的细胞及Matrigel,对穿过小室的细胞进行结晶紫染色,显微镜下观察,行细胞计数并分析实验结果。6.Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测乳腺癌细胞增殖能力6.1沉默和过表达目的蛋白组别及转染时间设置为了验证Ezrin/p65相互作用对乳腺癌细胞增殖的影响,设置组别分别为：①空载组；②沉默Ezrin:③沉默p65；④沉默Ezrin和p65；⑤沉默Ezrin过表达p65；⑥沉默p65过表达Ezrin.为了验证Ezrin/Smad2相互作用对乳腺癌细胞增殖的影响,设置组别分别为：①空载组；②沉默Ezrin:③沉默Smad2:④沉默Ezrin和Smad2:⑤沉默Ezrin过表达Smad2:⑥沉默Smad2过表达Ezrin.在乳腺癌细胞MDA.MB.231和MCF-7,针对每种细胞各同时转染5块96孔板,转染时间设置为24h,48h,72h,96h和120h。6.2 CCK-8联用酶标仪检测细胞增殖在按照上述组别设置处理过的乳腺癌细胞中,按照设置的转染时间点加入CCK-8检测液,20min后使用酶标仪设定吸光度450nm,检测乳腺癌细胞的吸光度(Optical density,OD)值并分析结果。研究结果1.乳腺癌细胞MDA.MB.231中基于Ezrin相互作用的蛋白网络初次IP联用CBB染色验证了富集的Ezrin蛋白,通过联用LCMS法共检测得到1889种与Ezrin存在相互作用的蛋白,其中包括p65和Smad2蛋白。二次IP联用银染,对比IgG对照,通过LCMS法验证了Ezrin及其相互作用蛋白p65和Smad2。2. Ezrin/p65相互作用在乳腺癌细胞中的鉴定结果2.1内源性Ezrin/p65相互作用鉴定结果Co-IP及WB结果显示,在MDA-MB-231和MCF-7细胞中,Ezrin/p65相互作用主要存在于胞浆,而在胞核中未检测出。iF结果显示,Ezrin与p65主要共定位于胞浆,极少数共定位于胞核。上述两个结果互相印证。2.2外源性Ezrin/p65相互作用鉴定结果共转染3×Flag-Ezrin-6×His和GFP-RelA, Co-IP和WB结果显示,在MDA-MB-231和MCF-7细胞中,Ezrin/p65相互作用主要存在于胞浆,而在胞核中未检测出。IF结果显示,Ezrin与p65主要共定位于胞浆,极少数共定位于胞核。上述两个结果互相印证。3. Ezrin/Smad2相互作用在乳腺癌细胞中的鉴定结果3.1内源性Ezrin/Smad2相互作用鉴定结果Co-IP及WB结果显示,在MDA-MB-231细胞的胞浆和胞核中,Ezrin/Smad2均存在明显PPI；在MCF-7细胞中,Ezrin/Smad2相互作用主要存在于胞浆,而在胞核中未检测出。IF结果显示,在MDA-MB-231细胞中,Ezrin与Smad2明显共定位于胞浆和胞核；在MCF-7细胞中,Ezrin与Smad2明显共定位于胞浆,而在胞核中未能检测出。上述两个结果互相印证。3.2外源性Ezrin/Smad2相互作用鉴定结果共转染3×Flag-Ezrin-6×His和Smad2-HA, Co-IP和WB结果显示,在MDA-MB-231细胞的胞浆和胞核中,Ezrin/Smad2均存在明显的pPI；在MCF-7细胞中,Ezrin/Smad2相互作用主要存在于胞浆,而在胞核中未检测出。IF结果显示,在MDA-MB-231细胞中,Ezrin与Smad2明显共定位于胞浆和胞核；在MCF-7细胞中,Ezrin与Smad2明显共定位于胞浆,而在胞核中未能检测出。上述两个结果互相印证。4. Ezrin/p65, Ezrin/Smad2相互作用促进乳腺癌细胞的侵袭在MDA-MB-231和MCF-7细胞中,①单独沉默Ezrin、 p65或Smad2,镜下穿过transwell小室的细胞计数与空载组相比减少,差异均具有统计学意义(P<0.05)；②过表达p65或Smad2与空载组相比,镜下细胞计数增多,差异具有统计学意义(P<0.05)；③沉默Ezrin但过表达p65或Smad2组,其细胞计数均比单独沉默Ezrin组增多,差异具有统计学意义(P<0.05)；④沉默Ezrin但过表达p65或Smad2组,其细胞计数比仅过表达p65或Smad2组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明,沉默Ezrin能够抑制过表达p65或Smad2对乳腺癌细胞侵袭的促进作用,提示p65或Smad2对乳腺癌细胞侵袭的促进作用依赖于Ezrin的表达,且Ezrin/p65, Ezrin/Smad2相互作用能够促进乳腺癌细胞的侵袭。5. Ezrin/p65, Ezrin/Smad2相互作用对乳腺癌细胞增殖没有影响5.1 Ezrin/p65, Ezrin/Smad2相互作用对MDA-MB-231细胞增殖没有影响针对Ezrin/p65相互作用对MDA-MB-231细胞增殖的影响,析因分析结果显示,天数与组别之间存在交互作用(F=8.29,P=0.00)。调整R2=0.93。经成对比较,第一天(转染24h)各组之间无统计学差异(F=0.03,P=0.99)；第二天到第五天(转染48-120h),各组差异具有统计学意义(P<0.05)；经过两两比较,各实验组与空载组之间差异有统计学意义(P<0.05),而实验组之间的差异无统计学意义。针对Ezrin/Smad2相互作用对MDA-MB-231细胞增殖的影响,析因分析结果显示,天数与组别之间存在交互作用(F=7.24,P=0.00)。调整R2=0.92。经成对比较,第一天(转染24h)各组之间无统计学差异(F=0.03,P=0.92)；第二天到第五天(转染48-120h),各组之间差异具有统计学意义(P<0.05)；经过两两比较,各实验组与空载组之间差异均有统计学意义(P<0.05),而实验组之间差异无统计学意义。5.2 Ezrin/p65,Ezrin/Smad2相互作用对MCF-7细胞增殖没有影响针对Ezrin/p65相互作用对MCF-7细胞增殖的影响,析因分析结果显示,天数与组别之间存在交互作用(F=5.80,P=0.00)。调整R2=0.96。经过成对比较,第1天(转染24h,F=0.12,P=0.98)及第2天(转染48h,F=1.09,P=0.38)各组之间无统计学差异；第3天到第5天(转染72-120h),各组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。经过两两比较,各实验组与空载组之间差异有统计学意义(P<0.05),而实验组之间差异无统计学意义。针对Ezrin/Smad2相互作用对MCF-7细胞增殖的影响,析因分析结果显示,天数与组别之间存在交互作用(F=11.84,P=0.00)。调整R2=0.98。经过成对比较,第1天(转染24h,F=0.94,P=0.46)及第2天(转染48h,F=1.97,P=0.10)各组之间无统计学差异；第3天到第5天(转染72-120h),各组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。经过两两比较,各实验组与空载之间差异均有统计学意义(P<0.05),而实验组之间差异无统计学意义。结论1.在乳腺癌细胞MDA-MB-231全细胞裂解液中,共发现1889种与Ezrin相结合的蛋白,其中包括p65和Smad2蛋白。2.在MDA-MB-231和MCF-7细胞系中, Ezrin与p65蛋白之间均存在相互作用,主要存在且共定位于细胞浆。3.在MDA-MB-231和MCF-7细胞系中,Ezrin与Smad2蛋白之间均存在相互作用,但在MDA-MB-231细胞中,该相互作用存在且共定位于细胞浆与细胞核,而在MCF-7细胞中,该相互作用主要存在且共定位于细胞浆,而在细胞核中未检测出明显的相互作用或共定位。4. Ezrin与p65, Ezrin与Smad2蛋白之间的相互作用能够促进乳腺癌转移。5. Ezrin与p65, Ezrin与Smad2蛋白之间的相互作用对MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖没有影响。