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泡沫化巨噬细胞滞留在斑块内已经成为动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)损伤的标志性事件。本研究证实,ox-LDL诱导巨噬细胞形成巨噬源性泡沫细胞后,神经导向因子netrin-1及其受体UNC5b的表达上调,导致巨噬源性泡沫细胞迁移、能力下降,从而滞留斑块内,促进AS的进展。然而,netrin-1和UNC5b影响泡沫细胞迁移能力的机制目前还不是很清楚。UNC5b是巨噬细胞膜上的受体糖蛋白,巨噬细胞泡沫化后UNC5b岩藻糖基化修饰是否改变,与泡沫细胞运动能力下降是否相关,目前还不是很清楚。本课题利用糖生物学和分子生物学技术,深入探讨UNC5b岩藻糖基化修饰对泡沫细胞移动能力的影响以及相关分子机制。进而,阐明UNC5b糖基化修饰与泡沫巨噬细胞运动能力的关系,探究泡沫化巨噬细胞游出动脉内膜,促进斑块消退的可能途径,为血管炎症损伤疾病的防治提供一个新的治疗靶点及思路。第一部分ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化后UNC5b表达变化及运动能力的改变目的:以Raw264.7巨噬细胞和腹膜巨噬细胞为研究对象,ox-LDL诱导泡沫细胞模型,研究UNC5b是否能够抑制泡沫化巨噬细胞的迁移、运动,建立后续实验细胞模型。方法:1.采用胆固醇酯测定和油红O染色检测ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞,细胞内脂质含量的和胆固醇酯比例的改变,确定体外实验的ox-LDL浓度和作用时间。2.利用Transwell实验和划痕实验(Wound healing assay)检测ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化后,迁移运动能力的变化。3.利用WB、RT-PCR和免疫荧光染色实验检测ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中UNC5b及netrin-1表达的变化。4.构建si UNC5b瞬时干扰模型和UNC5b过表达模型,检测UNC5b表达变化对泡沫细胞运动能力的影响。结果:1.50μg/ml的ox-LDL,诱导24 h,Raw264.7巨噬细胞内胆固醇酯比例和脂质明显增加,表明巨噬细胞泡沫化模型建立成功。2.利用Transwell实验和划痕实验证实ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化后,迁移运动能力明显下降(p<0.05)。3.ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞和腹膜巨噬细胞泡沫化后,UNC5b及netrin-1表达明显上调(p<0.05)。4.放线菌素(AMD)或放线菌酮(CHX)预处理Raw264.7巨噬细胞,再通过ox-LDL诱导泡沫化证实ox-LDL对UNC5b的调控位于UNC5b基因转录水平。5.双荧光素酶报告实验表明ox-LDL可增强UNC5b的启动子活性。NF-κB抑制剂预处理Raw264.7巨噬细胞后,UNC5b启动子活性明显下降。表明ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中,通过激活NF-κB通路上调UNC5b启动子活性,进而导致UNC5b蛋白含量增加。6.通过构建si UNC5b瞬时干扰模型和UNC5b过表达模型,证实ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化后上调UNC5b表达导致泡沫细胞迁移、运动能力下降。结论:ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化后,激活NF-κB通路,从而增强UNC5b启动子活性,UNC5b的表达上调,使巨噬细胞泡沫化后迁移运、动能力下降。第二部分UNC5b岩藻糖基化修饰水平与泡沫细胞迁移能力的改变的关系目的:研究巨噬细胞泡沫化过程中UNC5b的不同糖基化修饰水平变化及糖基转移酶的表达变化;探讨UNC5b的糖基化与其功能的关系,UNC5b的糖基化改变是否影响泡沫化巨噬细胞的迁移运动能力。方法:1.利用凝集素Blot的方法筛选ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化后总蛋白糖基化修饰水平的变化。2.利用WB和RT-PCR检测ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化过程中不同类型的岩藻糖基转移酶(FUT)表达变化。3.利用WB、RT-PCR、免疫荧光染色、免疫沉淀和点突变检测ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化过程中UNC5b岩藻糖修饰水平变化。4.利用Transwell实验和划痕实验检测ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化后FUT8表达变化对泡沫运动能力的影响结果:1.巨噬细胞泡沫化后总蛋白的岩藻糖基化修饰水平明显上升,其中α-1,6岩藻糖基化修饰水平明显上升(p<0.05)。表明巨噬细胞岩藻糖基化修饰可能与巨噬细胞泡沫化密切相关。2.实验表明ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中FUT8的表达明显上调(p<0.05)。3.ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞后,经IP实验证实UNC5b是ox-LDL诱导的岩藻糖基化修饰的靶蛋白。4.UNC5b和FUT8质粒共转染293T细胞,免疫荧光检测UNC5b与FUT8在内质网上同定位,进一步证实FUT8催化UNC5b的α-1,6岩藻糖基化修饰。同时细胞膜上也可见UNC5b的绿色荧光分布。而点突变的UNC5b-KO222,347和FUT8虽然定位在内质网上,但细胞膜上没有UNC5b-KO222,347的绿色荧光分布。表明,UNC5b的岩藻糖基化修饰发生在内质网,并且被FUT8修饰的UNC5b才能正确的表达于细胞膜上,发挥正常生物学功能。5.FUT8在细胞泡沫化过程中的确参与调控细胞的迁移能力,并且与UNC5b岩藻糖基化水平有关。结论:ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化后,上调FUT8的表达,UNC5b的α-1,6岩藻糖基化修饰水平增加,导致巨噬细胞泡沫化后迁移、运动能力下降。第三部分UNC5b致巨噬源性泡沫细胞运动能力下调的分子机制目的:探索UNC5b导致泡沫细胞迁移、运动能力下调的分子机制。方法:1.利用WB和RT-PCR检测ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化后CCR7的表达变化。2.通过构建si UNC5b瞬时干扰模型和UNC5b过表达模型,利用Transwell实验和划痕检测ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化过程中UNC5b是否通过下调CCR7导致泡沫细胞迁移、运动下降。3.利用带有荧光标记的鬼笔环肽检测ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化过程中,F-actin聚合情况。4.巨噬细胞泡沫化后,分析下游Rac1、CDC42、PAK等信号通路激活状态。分析相应的参与细胞运动相关的分子机制。结果:1.ox-LDL诱导Raw264.7巨噬细胞泡沫化过程中UNC5b下调CCR7的表达(p<0.05),导致的泡沫化巨噬细胞迁移运动能力下降。2.实验表明ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中,F-actin聚合明显下降。3.巨噬细胞泡沫化后,通过下调CDC42、上调PAK导致泡沫化巨噬细胞F-actin聚合受阻,使泡沫细胞迁移运动能力下调。结论:UNC5b通过下调CCR7表达,抑制巨噬源性泡沫细胞迁移。UNC5b通过下调CDC42、上调PAK导致泡沫化巨噬细胞F-actin聚合受阻,使泡沫细胞迁移运动能力下降。第四部分UNC5b表达变化与动脉粥样硬化斑块形成的关系目的:利用Apo E-/-小鼠验证UNC5b表达与动脉粥样硬化斑块发生、发展的关系。方法:36只雄性ApoE-/-小鼠,建立动脉粥样硬化动物模型。普通饲料组(Vehicle group,6只)普通饲料喂养12周后处死取材;基线组(Baseline group,6只)高脂高胆固醇饲料喂养12周后处死取材;斑块进展组(Development group,6只)高脂高胆固醇饲料喂养16周,后4周同时尾静脉注射生理盐水;腺病毒空载组(Ad-NC group,6只)高脂高胆固醇饲料喂养16周,后4周同时尾静脉注射空载腺病毒;腺病毒敲低UNC5b组(Ad-sh group,6只)高脂高胆固醇饲料喂养16周,后4周同时尾静脉注射sh UNC5b腺病毒;腺病毒过表达UNC5b组(Ad-EX group,6只)高脂高胆固醇饲料喂养16周,后4周同时尾静脉注射ex UNC5b腺病毒。生化分析六组小鼠血清中的血脂水平、肝功能和血糖水平;HE染色判断主动脉根部和主动脉弓内膜的厚度;冰冻切片油红O染色判断主动脉根部斑块面积与UNC5b表达的关系;冰冻切片免疫荧光染色定位UNC5b表达与斑块大小的情况,明确AS模型的建立、发展和消退情况。最后通过免疫组化染色检测主动脉根部斑块中CD68含量的变化。结果:1.与普通饲料相比,其余各组血清中TC、TG和LDL-C水平明显升高。主动脉根部和主动脉弓HE染色结果显示,sh UNC5b组的内膜厚度明显变薄;ex UNC5b组内膜最厚。油红O染色结果,ex UNC5b组的主动脉根部斑块面积最大;sh UNC5b组斑块明显消退、斑块面积减小。上述结果表明AS发生、发展与UNC5b的表达密切相关。2.免疫组化染色结果CD68含量与UNC5b的表达呈正相关。3.免疫荧光染色结果表明UNC5b和FUT8的表达与AS斑块的面积呈正相关结论:UNC5b的表达与AS斑块的面积呈正相关。