论文部分内容阅读
禽流感病毒的宿主范围十分广泛,不仅给禽类养殖带来了巨大的经济损失而且严重威胁着人类健康。事实上,野生水禽是禽流感病毒的天然储存宿主,禽流感病毒必须克服多种生物学障碍,才能实现跨物种传播,感染哺乳动物。宿主因子人源的酸性富含亮氨酸核磷酸蛋白家族成员 A（acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A,ANP32A）限制了禽流感病毒聚合酶的活性,但在人源细胞上过表达禽源ANP32A可以恢复其活性。与人源ANP32A相比,禽源ANP32A有33或29个氨基酸的插入（ch-ANP32A-33、ch-ANP32A-29）,并且 ch-ANP32A-33 比 ch-ANP32A-29对禽源聚合酶活性的刺激作用更强。ch-ANP32A-33和ch-ANP32A-29的相对含量在不同物种相差很大,并与禽流感病毒的跨物种传播密切相关,但是调节禽源ANP32A选择性剪接的机制还不清楚。本文探究了调节禽源ANP32A选择性剪接产生ch-ANP32A-33和ch-ANP32A-29的机制以及这种选择性剪接的调控机制对于禽流感病毒聚合酶的影响,内容如下:1.调控禽源ANP32A选择性剪接的剪接因子的鉴定通过RT-PCR和高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并区分在DF-1、DEF细胞中由禽源ANP32A选择性剪接产生的ch-ANP32A-33和ch-ANP32A-29,并且发现ch-ANP32A-29 分别占到总量（ch-ANP32A-33+ch-ANP32A-29）的 22.4%和 17.4%左右。运用相同方法,比较鸡的心、肝、脾、肺、肾中的禽源ANP32A的剪接模式,结果显示在鸡的心、肝、脾、肺、肾内ch-ANP32A-33和ch-ANP32A-29的分布情况相似,没有组织特异性。ch-ANP32A-33和ch-ANP32A-29分别是由禽源ANP32A的内含子4远端和近端3’剪接位点剪接而产生的。剪接位点的选择性剪接受到相邻外显子上的顺式作用元件和与之结合的反式作用因子的调控。为了找到影响禽源ANP32A内含子4 3’剪接位点选择的顺式作用元件,构建了禽源ANP32A的微型基因载体。将禽源ANP32A基因的部分序列（完整的外显子4、内含子4、外显子5序列以及内含子5的前150位碱基）连接到真核表达载体上,以此模拟内源ANP32A基因的选择性剪接。进一步的将外显子5中的第16-30、31-45、46-60、61-75、76-80位碱基依次缺失构建了四个微型基因突变体。将微型基因转染到DF-1细胞,通过RT-PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳发现缺失外显子5第31-45位碱基可以使ch-ANP32A-29的量降低,ch-ANP32A-33的量升高,ch-ANP32A-29的比率由总量的37%降到16%。这说明影响禽源ANP32A选择性剪接的顺式作用元件位于外显子5第31-45位碱基。设计合成包含外显子5第31-45位碱基（顺式作用元件）的生物素标记的RNA探针,同时以包含外显子5第46-60位碱基和随机序列的RNA探针作为对照,进行RNA亲和纯化和质谱分析。结果显示包含顺式作用元件的RNA探针特异性的钓取了 78个蛋白质,从中筛选到了反式作用因子富含丝氨酸/精氨酸剪接因子10（serine/arginine-rich splicing factor10,SRSF10）蛋白。通过 RNA 免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）发现SRSF10蛋白特异性的和ANP32A mRNA结合,进一步地验证了质谱结果。2.SRSF10通过调控禽源ANP32A的选择性剪接抑制禽流感病毒聚合酶的活性构建SRSF10的真核表达载体,表达后检测到ch-ANP32A-29的量升高,ch-ANP32A-33的量降低,ch-ANP32A-29的比例由23%上升到39%。转染针对ch-ANP32A-33和ch-ANP32A-29的共有序列小干扰RNA,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,两种亚型的量均减少,且比例维持不变,表现出其对两种亚型具有相同的干扰效果。在干扰的基础上进行了聚合酶活性实验,结果显示针对禽源ANP32A的敲低抑制了H9N2的聚合酶活性。在干扰基础上单独回补ch-ANP32A-29。结果显示回补后聚合酶活性升高,且呈现剂量依赖性但没有恢复到原来的水平。说明ch-ANP32A-29对禽源聚合酶活性的促进能力不及ch-ANP32A-33,表现为在ch-ANP32A-29的增加和ch-ANP32A-33的下降的共同作用下禽流感病毒聚合酶活性下降。在有或没有ch-ANP32A-33共转的情况下,转染SRSF10和聚合酶相关质粒。检测聚合酶活性发现ch-ANP32A-33的表达能部分恢复SRSF10引起的禽流感病毒聚合酶活性的下降。通过聚合酶活性实验发现SRSF10的过表达抑制了禽源特征性的PR8 PB2 K627E和H9N2病毒的聚合酶活性。在DF-1细胞上过表达SRSF10后感染PR8 PB2K627E和H9N2病毒。实验结果显示SRSF10的过表达在24 h抑制了 PR8 PB2 K627E和H9N2病毒NP蛋白表达,并且降低了这两种病毒的病毒滴度,而在48h均没有影响。说明SRSF10的过表达在早期抑制了禽流感病毒复制。与之相对应的是,SRSF10的过表达对适应于哺乳动物的PR8病毒的聚合酶活性的抑制程度较弱,并对其复制没有影响。综上所述,我们初步探索了禽源ANP32A选择性剪接的机制,首次发现SRSF10通过与其相应的顺式作用元件结合来调节禽源ANP32A内含子4 3’剪接位点的选择性剪接,表现为降低ch-ANP32A-33的量和增加ch-ANP32A-29的量,而这一作用可以抑制禽流感病毒的聚合酶活性。