研究背景：糖尿病是当前威胁人类健康的最重要的非传染性疾病之一,糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的慢性并发症,独立于高血压和冠状动脉病变的发生,是一种特异性的心肌病变,可诱发心力衰竭、心律失常、心源性休克和猝死,该病变可加重同时患有其他心脏病的患者的预后,目前依然是糖尿病患者主要的死亡原因。其发病机制非常复杂,目前认为肾素-血管紧张素-醛固酮系统、氧化应激、炎性因子、生长因子、细胞外基质等与之密切相关,参与了糖尿病心肌病的发生和发展。其主要的病理改变为心肌微血管壁增厚、管腔狭窄,细胞外基质沉积和心肌纤维化等,其中心肌纤维化是糖尿病心肌病特征性病理表现。心脏的细胞成分主要以心肌细胞和心肌成纤维细胞为主,约占心脏总细胞数的90%,而心肌成纤维细胞又约占心脏全部细胞数的60%-70%,是心脏中最多的细胞类型。生理状态下的心肌成纤维细胞处于功能静止状态,称为纤维细胞,在心肌纤维化过程中,在各种信号因子如转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、核转录因子(NF-κβ)、活化T细胞核因子(NFAT)等的刺激下,纤维细胞转化成成纤维细胞,分泌大量的纤维(Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白)和基质,形成瘢痕组织,可防止心脏破裂。同时,由于过度的分泌大量的纤维和基质,造成细胞外基质沉积,心脏组织中胶原浓度显著升高,Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量明显增多,各型胶原比例失调,最终导致心肌纤维化(Myocardial fibrosis, MF)近年来研究发现TGF-β与糖尿病心肌纤维化的形成有着密切的关系。TGF-β是一类具有多种功能的细胞因子,广泛参与了对炎症、细胞外基质沉积的调节,对细胞的增殖、分化以及生长等多种生理及病理过程也起着重要的调节作用,是细胞外基质最重要的调节因子,也是目前明确了的与组织纤维化关系最为密切的细胞因子,它可通过Smads信号途径、蛋白激酶C途径、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径来发挥生物学作用,其中TGF-β1/Smads信号途径被认为作用是最显著的、最经典的途径。现有研究表明,糖尿病状态下心脏TGF-β1/Smads信号通路激活与心肌纤维化的发生、发展有着密切关系。但到目前为止对心肌纤维化的治疗缺乏有效的手段,中医药在抗心肌纤维化的过程中,也发挥着重要作用。从研究TGF-β1/Smads信号通路调控异常在糖尿病心肌纤维化中的作用,以及中药能否通过调控TGF-β1/Smads信号通路减轻糖尿病心肌纤维化、从而改善心脏功能入手,探讨中药防治糖尿病心肌纤维化的可行性。研究目的：采用高糖处理的成纤维细胞来模拟糖尿病模型,观察应用不同剂量的通心络处理是否能抑制成纤维细胞增殖的作用,并检测TGF-β1/Smads通路相关因子的表达水平,从该通路的角度来探讨其对高糖条件下的成纤维细胞的调节作用。通过采用高脂饮食及小剂量链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)腹腔注射来诱导糖尿病心肌病(DCM)模型,并采用不同剂量的通心络进行干预,探讨通心络处理能否改善其心肌间质纤维化和心脏功能,并进一步探讨其对心肌组织内TGF-β1/Smads通路相关因子的表达水平的影响,为中药防治糖尿病心肌纤维化寻找新的靶点。研究方法：1、体外实验：体外复苏培养大鼠心肌成纤维细胞,取正常培养基(含5mmol/L葡萄糖)作对对照组,并采用25mmol/L葡萄糖处理24h,同时设低、中、高剂量的通心络、缬沙坦进行处理后采用MTT检测细胞增殖和活力,用吸光度(0D值)来表示。在此基础上,应用酶联免疫吸附(ELISA)检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1蛋白表达水平；应用免疫荧光染色技术检测TGF-β1蛋白表达水平；应用免疫荧光染色和免疫印迹技术检测磷酸化(phospho)-Smad2.phospho-Smad3及Smad的蛋白表达水平。2、体内实验：高脂饮食喂养大鼠4W后,采用胰岛素敏感指数ISI判定大鼠出现胰岛素抵抗后,尾静脉注射小剂量STZ溶液注射以制备糖尿病模型,模型制备成功后将其分为糖尿病心肌病组(DCM)、通心络低剂量组(TXL-L)、通心络中剂量组(TXL-M)、通心络高剂量组(TXL-H)、日性药物组(positive),另取10只健康大鼠作为对照组(CON),每组各10只,继续喂养12周。检测指标如下：①观察并记录大鼠的体重、毛色、饮食、排便等一般状态及血糖浓度；②造模后12周末、取材前,心导管法检测左室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)；③取心脏,滤纸吸干后称重全心、左心室,计算大鼠心脏重量指数和左心室重量指数。④部分标本制备石蜡切片、HE染色、光镜下观察各组心肌组织的变化情况；⑤Masson染色,测定心肌间质胶原容积分数；⑥应用免疫组化染色及酶联免疫吸附(ELISA)检测TGF-β蛋白表达水平；⑦应用免疫组化染色及免疫印迹技术检测phospho-Smad2、 phospho-Smad3及Smad7的蛋白表达水平。结果：1、体外实验结果： (1)MTT检测：①高糖(25mmol/L)作用时间筛选结果：经高糖处理后随处理时间的延长,OD值逐渐增高,于24h达峰值,而48h时后则显著降低。此结果提示高糖处理24h时成纤维细胞活力最强。②通心络作用效果筛选：与对照组比较,随时间的延长,模型组的0D值显著升高；采用低、中、高剂量的通心络干预后,0D值显著下降,提示各剂量的通心络均能明显抑制成纤维细胞的增殖和活力。(2)Ⅰ、Ⅲ型胶原的ELISA检测结果：实验末高糖处理组(Model)水平明显高于正常对照组(CON),而通心络各处理组的表达水平与Model组比较有明显的降低,其中以高剂量组降低最为明显。(3) TGF-β1蛋白表达水平检测：免疫荧光染色和ELISA检测结果显示,实验末高糖处理组(Model)组的TGF-β1水平明显高于CON组,而通心络处理组的TGF-β1水平与Model组比较有明显的降低,其中以高剂量组降低最为明显,且通心络高剂量处理组显著低于阳性药物组。(4) phopho-Smad2、Smad3及Smad7的蛋白表达水平检测：免疫荧光染色和免疫印迹结果显示,实验末Model组的phospho-Smad2、Smad3蛋白表达水平明显高于CON组,而通心络处理组的蛋白表达水平与Model组比较有明显的降低,其中以高剂量组降低最为明显；通心络中剂量处理组与阳性药物组比较无显著差异,但高剂量处理组显著低于阳性药物组。Smad7的阳性表达定位于细胞质。CON组可见少量S mad7表达的阳性细胞,Model组可见明显的Smad表达细胞,而通心络各处理组可见大量的Smad表达的阳性细胞,其中以高剂量组表达最多。2、体内实验结果：(1)大鼠体重、胰岛素敏感指数、血糖检测及一般状态观察：各组大鼠初始体重无显著差异。于实验第4周末时,与正常对照组(普通饲料喂养)比较,其它组大鼠(高脂饮食喂养)。体重显著增加,说明高脂饮食喂养后大鼠的体重会显著增加,促使大鼠肥胖,形成胰岛素抵抗,从而有利于糖尿病模型的建立。大鼠血糖及胰岛素敏感指数ISI检测结果显示,于高脂饲料喂养4周末,DCM组、通心络各处理组、阳性药物组的空腹胰岛素水平显著升高,胰岛素敏感指数显著降低,大鼠成模后至实验末,DCM组、通心络各处理组、阳性药物组的空腹血糖值均显著高于正常对照组。(2)一般状态观察：CON组一般状态良好,大鼠饮食、饮水及尿量无明显变化；DCM组大鼠出现“三多一少”症状；与DCM组比较,通心络各处理组大鼠一般状态呈不同程度的改善,尤其以通心络高剂量组改善最为明显。(3)血流动力学变化：实验末DCM组的左室收缩压(LVSP)、左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左室内压最大下降速率(-dp/dtmax)明显低于CON组,而通心络处理组与DCM组比较有明显的升高,其中以高剂量组升高最为明显；实验末DCM组的左室舒张末压(LVEDP)明显高于CON组,而通心络处理组的LVEDP与DCM组比较有明显的降低,其中以高剂量组降低最为明显,且通心络中、高剂量处理组与阳性药物组比较无显著差异。 (4)大鼠心脏重量指数、左心室重量指数检测结果：实验末DCM组的心脏重量指数和左心室重量指数明显高于CON组,而通心络处理组的左心室重量指数与DCM组比较有明显的降低,其中以高剂量组降低最为明显,且优于阳性药物组。(5)HE染色结果：CON组大鼠心肌组织为正常结构。而DCM组大鼠心肌组织排列紊乱,细胞间隙增大,间质纤维化明显,细胞大小不规则。通心络各处理组心肌组织的情况较DCM组有明显改善,细胞形态和间质纤维化程度均有明显减轻,以高剂量组改善最为明显。(6) Masson染色结果及胶原容积分数：CON组大鼠有少量间质；DCM组大鼠心肌组织排列紊乱,间质和血管周围的胶原纤维量显著增多,胶原容积分数明显增大,间质纤维化明显。通心络各处理组心肌组织纤维化的情况较DCM组有明显改善,胶原容积分数明显减少,以高剂量组改善最为明显,且通心络中、高剂量组的胶原容积分数明显低于阳性药物组。(7)TGF-β1蛋白表达水平检测：免疫组化及ELISA检测结果显示,实验末DCM组的TGF-β1水平明显高于CON组,而通心络处理组的TGF-β1水平与DCM组比较有明显的降低,其中以高剂量组降低最为明显,且通心络中、高剂量处理组与阳性药物组比较无显著差异。(8) phopho-Smad2、Smad3及Smad7的蛋白表达水平检测：免疫组化及免疫印迹结果显示：DCM组的phospho-Smad2、Smad3蛋白表达水平明显高于CON组,而通心络处理组的phospho-Smad2、Smad3蛋白表达水平与DCM组比较有明显的降低,其中以高剂量组降低最为明显,且通心络中、高剂量处理组与阳性药物组比较无显著差异；DCM组的Smad7蛋白表达水平明显高于CON组,而通心络处理组的S mad7蛋白表达水平与DCM组比较有明显的增高,其中以高剂量组升高最为明显,且通心络中、低剂量组与阳性药物组比较无显著差异,但高剂量处理组的Smad7蛋白表达水平显著高于阳性药物组。结论：1、通心络能够明显抑制成纤维细胞的增殖和活力,从而抑制了Ⅰ、Ⅲ型胶原的活性,减少了Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌；2、通心络的上述作用可能是通过对TGF-β1/Smads通路的活化进行调节来实现的；3、通心络通过调控TGF-β1/Smads信号通路减轻了心肌间质纤维化,改善糖尿病大鼠的心脏功能,说明通心络对糖尿病心肌病大鼠的心脏功能具有保护作用。