桑黄子实体多糖的提取、纯化与体外抗氧化活性研究

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桑黄(Phellinus linteus)是药用真菌的一种,是目前公认的抗癌效率较高的一种药用大型真菌,其主要活性成分是多糖类物质,在医药领域具有重要的应用价值。本文分别采用热水法和超声波协同纤维素酶法(简称“协同提取法”)提取桑黄子实体多糖,并用不同浓度的乙醇沉淀,得到6种粗多糖;以非稳态扩散提取过程为基础建立动力学模型;运用大孔吸附树脂脱除粗多糖提取液中的色素;再通过DEAE-纤维素离子交换层析和Sephadex G-100凝胶排阻层析,分离纯化得到纯化多糖;通过对DPPH自由基(DPPH·)、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2·)的清除能力和总还原能力的测定,分别考察粗多糖和纯化多糖的抗氧化活性。本文主要研究结果如下:(1)协同法提取桑黄子实体多糖的优化工艺条件为:在料液比1:30(g/mL),超声频率为45KHz,加酶量为1%等确定条件下,超声温度54℃、pH5.1、超声时间39min、超声功率240w;在此优化条件下,桑黄多糖得率可达5.30%。(2)建立的热水提取过程和协同提取过程的动力学模型,在形式上均为:ln[(C)/(C-Ct)]=kt+ln[π2C/6(C-C0)];不同温度下,热水提取和协同提取的拟合方程相关系数R2均在0.86以上;热水提取过程的活化能为14.57KJ/mol;随着温度或功率的升高,多糖提取的半衰期减小;热水提取的有效扩散系数回归方程104Ds=0.3765exp(0.0153T),R2=0.9091,协同提取的有效扩散系数回归方程为104(Du+DE)=392.25exp(0.0013P),R2=0.9087。(3)对5种树脂进行静态吸附与解吸试验,静态试验表明DA201树脂对桑黄多糖提取液中的蛋白质和色素的吸附效果最好,色素的吸附率为75.38%,蛋白质的吸附率为63.04%;对于特定的多糖提取液,流速1.0ml/min,过DA201树脂柱需要连续进样10多个柱床体积(BV)才能使蛋白质和色素达到吸附饱和,总糖的吸附饱和点较早出现,吸附体积在4BV左右;7BV的蒸馏水可以基本将树脂吸附的水溶性色素、蛋白质等洗脱下来;50%的乙醇洗脱3BV时,总糖洗脱量最大,洗脱4BV时醇溶性色素洗脱量达到最大,在洗脱7BV时蛋白质达到最大解吸量。(4)通过对DPPH自由基(DPPH·)、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2·)的清除能力和总还原能力的测定,表明粗多糖体外抗氧化能力随着多糖浓度的增加而增大,其中粗多糖PIPsW80和PIPsC80的体外抗氧化能力最好;当浓度为1mg/ml时,PIPsW80和PIPsC80对超氧阴离子自由基的抑制能力分别为53%、57%。(5)对粗多糖PIPsW80和PIPsC80进行分离、纯化,并研究纯化后几种多糖组分的体外抗氧化能力。结果表明: DEAE-纤维素离子交换层析和Sephadex G-100凝胶排阻层析对桑黄多糖的分离效果明显,可以得到单一多糖,且纯化后的多糖均具有体外抗氧化活性;其中PIPsW80-1和PIPsW80-2均为纯多糖。
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