背景:特发性肺纤维化(idopathic pulmonary fibrosis,IPF)是间质性肺疾病中最主要的一种类型,主要临床表现为渐进性劳力性呼吸困难、限制性通气功能障碍伴弥散功能降低、低氧血症和双肺的弥漫性病变,最终导致呼吸衰竭而死亡。其病理改变起始于肺泡上皮细胞的损伤和成纤维细胞的激活,导致过度的细胞外基质胶原纤维增生并沉积于肺部,造成进行性、不可逆氧气交换能力的丧失。该病主要发病人群为60-70岁左右的中老年男性,全世界发病率在0.22-93.7/100,000人次不等(欧洲北美等地区发病率为2.8-9.3/100,000人次),男性发病率约为10.7/10万,女性为7.4/10万,全球每年大约有200-500万IPF新发患者。该病预后较差,诊断后中位生存期为3-5年,5年生存率仅有20%。目前临床采用多种药物手段及辅助措施对IPF患者进行诊疗,但治疗效果不甚理想,临床上能够改善该病预后及其死亡率的药物寥寥无几。大量的临床试验意在治疗干预手段上有所突破,并最大限度减缓或逆转该进程,但仍见效甚微。目前研究认为,肺泡上皮细胞的受损是造成肺纤维化的使动因素。上皮细胞受到外界或机体内病毒/烟草/大气颗粒/机械压力或遗传因素的作用,发生过度异常的反应,致使细胞凋亡,产生炎症或出现上皮间质转化,与此同时分泌过多生长因子,激活肺部固有成纤维细胞增殖或循环纤维细胞进入肺部,产生大量胶原纤维,形成肺部不可逆转的纤维重塑。内质网的生理功能对于维持细胞稳态和调节代谢途径具有重要作用。当机体打破这种平衡时,就会进入病理状态,导致代谢性疾病的发生。已有研究表明,内质网应激可导致肺泡上皮受损引起上皮再形成缺陷,是导致纤维化形成的主要因素。Caveolin-1(Cav1)是维持细胞膜烧瓶状结构的一种小窝蛋白,对于维持细胞的结构及其功能发挥有着重要作用,同时与机体的三大营养代谢,尤其与糖代谢和脂代谢密不可分。研究表明,缺乏Cav1的小鼠大多体型纤瘦,能够抵抗饮食导致的肥胖现象发生,餐后TAG和FFA水平增高,产生高胰岛素血症,同时伴有胰岛素抵抗。由此可见,Cav1在能量途径中的作用至关重要。肺部也是机体内一大重要代谢器官,如脂质合成由肺部远端的II型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial type II cells,ATII)实现。ATII细胞分泌脂类以生成肺泡表面活性蛋白,并在调节肺泡张力和肺部免疫方面起到重要作用。此外,业已研究证实,Cav1蛋白的缺失还可作为肺纤维化模型,即Cav1缺失可以导致TGF-β过度分泌,激活成纤维细胞从而启动其纤维化及炎症信号通路。然而,Cav1虽然可正常表达于肺泡上皮细胞,但细胞膜上却并没有小窝状的凹陷结构,由此可知Cav1除了发挥其脚手架功能介导细胞信号通路之外,还存在着与自身结构相关功能之外的作用。因此,我们推测Cav1缺陷导致的肺纤维化与能量代谢相关?本研究着重探讨Cav1对于能量代谢方面的调节,及其如何通过能量代谢的改变影响内质网应激的发生从而导致上皮细胞受损,致使肺纤维化的发生,目前该方面未有相关文献报道。方法:首先我们以4周及8-10周的Cav1-/-雄性小鼠和野生(Wide Type,WT)小鼠为研究对象,提取肺脏组织和肺泡灌洗液(bronchi alveolar lavage fluid,BALF),采用Sircol胶原检测法、ELISA、PCR检测胶原纤维在肺部的沉积量、TGF-β在肺部和BALF中的含量,以证实Cav1的缺失参与肺纤维化发病过程的时间。同时采用Western Blot(WB)法、原位末端转移酶标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)以及磁珠分选法,检测小鼠肺组织、体外人肺泡II型上皮Cav1-sh RNA-A549稳转细胞株及肺组织中分离所得ATII中的内质网应激蛋白、Caspase-3活性及其活性蛋白片段的表达水平以及ATII的凋亡情况,以明确Cav1参与肺纤维化的发病与内质网应激所致的肺内上皮细胞凋亡密切相关。其次,我们以Cav1-/-和WT雄性小鼠体内肺组织、体外A549细胞为研究对象,采用ATP能量检测试剂、电镜、Mitotracker示踪技术、Mito SOX染色及ROS检测试剂、膜电位检测试剂、WB等技术手段观察能量感受器分子AMPK的表达变化、线粒体的形态和数量、氧自由基的生成情况、膜电位的变化及肺组织和细胞内PGC1α的表达情况,以明确Cav1对于肺组织内和体外细胞线粒体功能的影响。为进一步明确其对于糖酵解途径的影响,我们采用PCR及WB方法检测糖酵解途径中的关键蛋白的变化水平,以明确糖酵解途径对于Cav1-/-小鼠肺纤维化的影响。最后,为明确Cav1缺陷导致的能量生成障碍对肺纤维化的影响,我们以Cav1基因敲除小鼠及体外Cav1-sh RNA-A549稳转细胞株为研究对象,给予糖酵解途径抑制剂2-DG12.5mg,连续腹腔注射一周后留取肺组织标本及BALF,采用Masson染色、WB、ELISA等手段对肺组织病理切片进行胶原染色、检测能量感受蛋白/内质网应激分子标志物在体内外的表达、TGF-β和胶原的分泌情况,观察2-DG对小鼠肺纤维化严重程度的影响。为进一步明确Cav1缺失参与肺纤维化的病理生理学过程与线粒体功能障碍导致的能量代谢失衡相关,我们给予PGC1α激动剂PQQ30mg/kg进行腹腔注射14天后留取肺组织标本及BALF,以及AMPK激动剂AICAR 5m M处理,观察线粒体的生成及能量供给恢复情况,检测小鼠内质网应激蛋白的变化水平。通过以上研究,最终得以阐明这样一个科学事实,即Cav1可通过调控线粒体功能和内质网应激参与到ATII的凋亡过程,并在肺纤维化的发生发展中发挥重要作用。结果:一、Cav1基因缺失对于肺纤维化的影响及内质网应激在肺纤维化中的作用首先,我们通过对肺组织及BALF中胶原蛋白和TGF-β的测定以及病理切片证实,Cav1基因缺失小鼠可在8周建立肺纤维化模型。此外,采用Western blot方法检测了小鼠肺组织、ATII和A549细胞中关于内质网应激的分子标志物,及Caspase-3活性蛋白片段的表达,观察ATII的凋亡情况。结果表明,Cav1-/-小鼠肺组织、ATII和A549细胞均出现不同程度的内质网应激,Caspase-3活性蛋白片段的激活,以及肺内上皮细胞凋亡过程的启动。说明Cav1基因缺失导致的肺纤维化可能与内质网应激所致的肺内上皮细胞凋亡密切相关。二、Cav1缺陷对线粒体形态功能及糖酵解途径的影响接着,我们观察到Cav1基因敲除小鼠肺组织内的AMPK磷酸化蛋白水平升高,为正常对照组B6/129小鼠的3倍,同时观察到其下游分子ACC的磷酸化水平也呈现上升趋势。此外,肺组织内的ATP含量降低,为其野生小鼠的一半。通过这些结果,我们可以确定Cav1基因敲除小鼠肺组织内存在能量代谢障碍。为了明确Cav1-/-小鼠发生纤维化主要与ATII相关,我们使用Cav1-sh RNA-A549细胞株检测其AMPK/ACC磷酸化蛋白的表达水平,同时检测细胞内的ATP含量,结果与体内肺组织数据相似,说明Cav1-/-小鼠的肺纤维化亦与ATII的能量代谢水平息息相关。WB方法得到Cav1基因敲除小鼠肺组织内的PGC1α水平明显降低,其表达水平为野生组的一半,PCR结果提示其在基因水平上亦显著下降。此外通过对ATII电镜下分析,Cav1-/-ATII细胞内的线粒体数量明显少于正常组。体外使用A549细胞检测PGC1α蛋白含量,发现Cav1-sh RNA-A549稳转细胞株中的PGC1α含量呈下降趋势,同时伴有线粒体膜电位升高。线粒体追踪指示剂Mitotracker显示低表达Cav1的细胞内绿色荧光强度较弱,同时Mito SOX显示红色荧光强度增强,说明线粒体数目减少同时氧自由基分泌明显升高。这些结果均说明Cav1的表达下降可导致细胞内线粒体数量减少,功能异常。最后采用PCR及WB方法检测糖酵解途径中的关键蛋白的变化水平,发现其表达水平均未有显著差异,说明糖酵解途径对于Cav1-/-小鼠肺纤维化的影响相较于线粒体的氧化磷酸化途径而言可忽略不计。以上结果说明Cav1基因缺失所导致的肺纤维化与线粒体功能障碍所引起的能量代谢失衡相关,而糖酵解通路对于肺纤维化的影响并不显著。三、干预Cav1-/-小鼠体内能量代谢对内质网应激的影响及其在肺纤维化中的作用在Cav1-/-小鼠体内给予糖酵解抑制剂2-DG后发现体内AMPK磷酸化蛋白的表达水平是其对照组的2倍,其下游分子ACC的磷酸化水平也相应升高。同时给予2-DG处理后启动了内质网应激途径,以IRE1通路最为显著,另观察到了Caspase-3活性蛋白片段的激活。肺组织及BALF中的胶原蛋白和TGF-β均较阴性组高出近2倍。肺组织的Masson胶原三色染色显示增多的蓝色胶原纤维条索。在体外Cav1-sh RNA-A549稳转细胞株中给予2-DG处理后,得到与体内趋势大致相似的结果。这些结果明确了Cav1-/-小鼠的肺纤维化与体内能量失衡所致的内质网应激密切相关,并加重了纤维化进程。另外,在Cav1-/-小鼠体内给予PGC1α激动剂PQQ后发现,PGC1α含量是其对照组的2倍。其余内质网应激分子标志物降低,TGF-β下降了20%,为330pg/ml。说明线粒体功能的改善在肺纤维化中发挥积极的保护作用。另外,我们尝试应用AMPK激动剂AICAR对Cav1-sh RNA-A549稳转细胞株进行治疗观察。发现细胞对内质网应激的反应能力增强,其标记物蛋白及caspase3活性片段的表达水平降低。ATP合成酶和PGC1α蛋白表达水平增高,ROS产物检测和Mito SOX染色提示氧自由基生成降低。说明AICAR在改善线粒体功能的同时减轻了内质网应激程度。综合以上结果说明抑制糖酵解途径可引起内质网应激反应加重,从而进一步加重Cav1-/-小鼠的肺纤维化程度。PQQ以及AICAR均能改善线粒体功能,减轻内质网应激反应,从而缓解Cav1-/-小鼠的肺纤维化程度。结论:一、Cav1-/-小鼠在出生8周后可成功建立肺纤维化模型,同时Cav1基因缺失导致的肺纤维化可能与内质网应激所致的肺内上皮细胞凋亡相关。二、Cav1基因缺失所导致的肺纤维化与线粒体功能障碍所引起的能量代谢失衡相关,而糖酵解通路对于肺纤维化的影响并不显著。三、抑制糖酵解途径导致能量代谢进一步失衡,并引起内质网应激反应加重,从而进一步加重Cav1-/-小鼠肺纤维化程度。PQQ以及AICAR均能改善线粒体功能,减轻内质网应激反应,缓解Cav1-/-小鼠的肺纤维化程度。