抑癌基因失活和原癌基因激活共同作用导致了肿瘤的发生。p53基因被认为是目前最重要的抑癌基因,50%人类肿瘤中都携带了能编码p53蛋白的错义突变或缺失的TP53基因。根据目前的文献报道,大多数情况下p53不仅缺失野生型的活性,而且还积极参与不同种类的肿瘤发生,通常被称作突变p53的功能获得(Gain-of-Function, GOF)。p53的功能获得主要体现在促进细胞增殖,增强细胞的抗凋亡能力,促进细胞的转移和浸润以及改变能量代谢等方面。此外,大量临床数据显示突变p53与肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐受性相关。因此了解突变p53的功能获得,尤其是了解其在肿瘤细胞获得性耐药中的作用机制将有助于我们进一步认识突变p53促进肿瘤发生的分子通路和机制,同时也可以为癌症的个性化治疗和药物靶点的选择提供重要理论依据。本实验室在前期研究工作中发现,突变p53蛋白p53N236S (p53S)并不仅仅是失去了野生型p53的功能,它还具有癌基因的潜能,能与Ras协同作用促进肿瘤发生,表明p53S与Ras协同获得了新功能。同时,这些数据也提示了p53S可能与Ras协同导致肿瘤细胞耐药。因此,本文针对p53S本身的功能获得尤其是导致肿瘤细胞获得性耐药的机制进行了研究。研究结果显示,p53S使肿瘤细胞具有抵抗化学药物诱导凋亡的特性,因而导致对抗肿瘤药物的耐受。我们用广谱抗肿瘤药物阿霉素(Dxorubicin)分别处理了p53S背景的四种细胞：p53S/S+Ras(在p53S/S细胞中转入Ras-pBabe载体,使Ras稳定表达),p53S/S+vector(在p53S/S细胞中转入空载体),p53S/++Ras, p53S/++vector;以及野生型细胞(WT)。MTT实验和Annexin-V染色实验结果表明,与野生型细胞相比,p53S/S+vector细胞对阿霉素处理的耐受性明显增加,更有趣的是,Ras的稳定表达进一步增强了这种耐受性。然后,我们对p53S/S+Ras和p53S/S细胞的耐药机制进行初步探索,通过Real-time PCR和Western Blot检测了p53S下游基因和蛋白的表达水平,结果发现,在DNA合成抑制剂阿霉素的处理下,p53N236S丧失了调控p21 Cipl/Wafl、PUMA等细胞周期及细胞凋亡相关通路蛋白表达的功能。这提示我们,p53S细胞中阿霉素引起的凋亡反应被削弱了,而且Ras的稳定表达促进了细胞抗凋亡的表型。同时,我们也检测了p16Ink4a, caspase-3和PARP等在p53S细胞中的表达水平,结果发现,相较于野生型细胞,p53S能明显地减弱PARP及凋亡执行者caspase-3的切割,即有效的阻止细胞发生凋亡行为。为了进一步研究p53S获得性耐药的分子机制,我们利用ChIP-on-Chip技术对受p53S调控的下游启动子进行整体分析,通过与野生型p53调控的下游基因对比,分析出p53S特有的调控基因,并从这些基因中筛选出与细胞周期和细胞凋亡相关的基因,如bid、caspase家族以及IAPs家族基因。根据被p53S调控的这些基因提示,预测了p53S可能参与调控内源性线粒体依赖的细胞凋亡途径中相关的分子通路。综上所述,本论文研究,发现了p53S能使肿瘤细胞具有抗凋亡以及对抗肿瘤药物耐受的特性,并在相关分子机理方面进行了初步探索。结果提示,.p53S细胞可能是通过调控细胞凋亡途径对化学药物产生抵抗作用。我们的研究可为临床上以p53突变为药物靶点的用药策略提供一定的理论基础。